JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
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Inizia con un tubo contenente batteri mobili che esprimono la proteina fluorescente verde.
Usando un ago, individua i batteri su una morbida piastra di agar nutriente per studiare la motilità della superficie batterica.
Quindi, capovolgere la piastra per evitare la condensa dell'acqua sulla superficie dell'agar.
Incubare la piastra per consentire ai batteri di crescere.
Man mano che l'incubazione procede, i batteri usano i loro flagelli per avviare la migrazione verso l'esterno dal punto di inoculazione.
Una volta completata l'incubazione, aprire il coperchio e posizionare la piastra capovolta in un sistema di imaging, con il lato dell'agar rivolto verso il rivelatore ottico, per garantire un imaging accurato.
Posizionare il coperchio pieno d'acqua sopra il piatto. Sigillarlo per mantenere un ambiente umido.
Chiudere il sistema di imaging e avviare l'acquisizione dell'immagine in time-lapse.
Nel tempo, la migrazione batterica genera proiezioni simili a dita verdi chiamate viticci. Queste strutture batteriche si estendono verso l'esterno dal punto di inoculazione centrale, confermando la motilità della superficie batterica.
Inoculare da uno a cinque microlitri di coltura notturna sulle piastre di agar a sciame essiccate colpendo la superficie dell'agar con uno stuzzicadenti sterile o un ago da inoculazione a filo, a seconda del ceppo batterico, trasferire le piastre di analisi a sciame in un incubatore con una temperatura impostata su 30 gradi Celsius, 37 gradi Celsius o 42 gradi Celsius. Capovolgere le piastre in modo che l'umidità in eccesso si condensi sul coperchio della piastra e non sull'agar, equilibrare i batteri a temperature specifiche del ceppo per due o quattro ore appena prima dell'imaging time-lapse.
Quindi, trasferire le piastre nell'unità di imaging in vivo in modo che i batteri sulla superficie dell'agar siano rivolti verso il basso verso la fotocamera invertita dell'unità. Riempi tutti i coperchi delle piastre di Petri con una piccola quantità d'acqua. Quindi posizionare ciascun coperchio con il lato dell'acqua rivolto verso l'alto sopra le piastre di agar capovolte.
All'interno dell'unità immagini, sigillare l'involucro di imaging per mantenere un livello di umidità costante, regolare le impostazioni di imaging dell'unità imaging e avviare l'imaging time-lapse dell'attività di sciamatura. Dopo l'imaging in tempo reale, la dinamica dello sciame dei batteri può essere analizzata utilizzando l'analisi delle immagini standard come l'immagine J.