Confronto fenotipico di ceppi wild-type e mutanti di Streptomyces coelicolor

Inizia con colture di ceppi selvatici e mutanti di Streptomyces coelicolor, un batterio filamentoso del suolo.

I ceppi mutanti portano mutazioni nei geni dello sviluppo che causano differenze fenotipiche rispetto al tipo selvatico.

Ricoltivare le colonie su piastre fresche per ridurre al minimo l'accumulo di mutazioni spontanee con l'età.

Striare singole colonie dei ceppi su regioni separate di una piastra in uno schema a cuneo per evitare la contaminazione incrociata

Incubare la piastra per favorire la crescita batterica.

I ceppi wild-type formano filamenti aerei che si sviluppano in lunghe catene di spore pigmentate di grigio, conferendo alle colonie un aspetto sfocato.

Al contrario, i ceppi mutanti non riescono a sviluppare filamenti aerei, con conseguente aspetto calvo, o producono meno spore pigmentate, facendo apparire bianchi i filamenti aerei.

Posiziona la capsula di Petri su uno sfondo uniforme per visualizzare la morfologia della colonia.

Acquisisci immagini per confrontare visivamente le differenze fenotipiche tra i ceppi wild-type e mutanti.

Utilizzare un metodo standard, come il metodo delle striature a quadranti dimostrato in Saunders 2012 per striare i ceppi di Streptomyces su piastre di agar MS e colture in singole colonie.

Ogni quattro o sei giorni, raccogli una singola colonia e rimettila su un piatto fresco. Man mano che le colonie invecchiano, diventano inclini a mutazioni casuali. Dopo aver effettuato la mutagenesi secondo il protocollo di testo, prendere nota della morfologia della colonia per ciascun mutante rispetto al ceppo parentale wild-type.

Quando si caratterizzano nuove specie di Streptomyces , confrontare il nuovo isolato con quello di una specie ben studiata notando la forma di base, la superficie della colonia, l'opacità, l'elevazione e la pigmentazione. Etichettare una piastra di agar MS e striare i ceppi wild-type e mutanti in modelli a cuneo. Fare attenzione che nessun ceppo tocchi un altro ceppo per evitare la contaminazione incrociata.

Notare la data e l'ora in cui le varietà sono striate sul piatto. Quindi incubare le piastre a 30 gradi Celsius. Ricordate che è estremamente importante proteggere sempre il campione di Streptomyces dalla contaminazione, utilizzare la migliore tecnica sterile per tutte le fasi aprendo piastre e provette per il minor tempo possibile.

Posiziona le piastre di Petri coltivate su carta colorata o bianca per omogeneizzare lo sfondo. Scrivi sul foglio il nome del ceppo, la data, la temperatura di incubazione e il tempo dalla prima striatura della piastra.

Scatta foto digitali della piastra con le informazioni sulla varietà scritte sullo sfondo di carta in modo che la confusione sia minima.