JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:35 min. • September 26th, 2025
Inizia con un vetrino a camera rivestito con una membrana supportata composta da fosfolipidi, inclusi i fosfolipidi biotinilati.
Incubare con neutravidina, che si lega alla biotina sul doppio strato. Lavare per rimuovere l'eccesso di neutravidina.
Introdurre un mezzo nutritivo contenente vescicole giganti o GV. Ogni GV è una vescicola sferica a doppio strato lipidico di dimensioni micron che incapsula una singola cellula batterica, fungendo da modello per studiare il comportamento delle singole cellule in un ambiente confinato.
La neutravidina si lega ai lipidi GV biotinilati, fissando le vescicole alla membrana supportata per un'osservazione stabile e a lungo termine in condizioni statiche.
Sigillare la camera per mantenere l'idratazione e ridurre al minimo la contaminazione.
Posizionare il vetrino su un tavolino da microscopio dotato di una piattaforma riscaldante per simulare le condizioni fisiologiche e osservare al microscopio.
I nutrienti del terreno si diffondono nel GV per sostenere la crescita batterica nel tempo.
Questa configurazione consente la visualizzazione in tempo reale della crescita batterica di singole cellule all'interno di microambienti di vescicole confinate.
Per immobilizzare le vescicole giganti sulla membrana a doppio strato di supporto, introdurre 10 microlitri di neutravidina nella soluzione acquosa esterna di vescicola gigante nel foro per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, lavare delicatamente il foro due volte con 20 microlitri di terreno LB, integrato con 200 millimolari di glucosio, e aggiungere l'intero volume della soluzione di vescicola gigante nel foro della camera. Quindi sigillare il foro con un vetro di copertura da 18 x 18 millimetri. Per monitorare la crescita batterica all'interno delle vescicole giganti, selezionare l'obiettivo 40X su un microscopio invertito e posizionare la camera sul sistema di riscaldamento del tavolino del microscopio.
Quindi incubare le vescicole giganti contenenti cellule batteriche nella camera in condizioni statiche per sei ore a 37 gradi Celsius, catturando e registrando immagini della crescita della cellula batterica ogni 30 minuti, con la fotocamera scientifica a semiconduttore di ossido di metallo complementare.