JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:35 min. • September 26th, 2025
Prelevare una piastra multipozzetto contenente terreno di coltura agar pre-spottato con batteri RNAi, con o senza un inserto specifico per il gene che ha come bersaglio un gene di C. elegans .
Il seme ha sincronizzato i vermi dello stadio L1 nei pozzetti e li ha incubati per consentire l'alimentazione dei batteri RNAi.
L'inserto produce RNA interferente che prende di mira specifici geni del verme, generando un fenotipo di knockdown specifico del gene.
Aggiungere un tampone ai pozzetti e risospendere delicatamente i vermi.
Trasferire la sospensione in una piastra a pozzetti profondi e lasciare che i vermi si depositino per gravità.
Rimuovere il surnatante, conservando un po' di tampone.
Lavare i vermi con il tampone, quindi scartare il surnatante, lasciando una piccola quantità di tampone.
Quindi, prelevare una piastra di analisi a più pozzetti contenente batteri patogeni.
Erogare un numero definito di vermi di controllo e knockdown nei rispettivi pozzetti per consentire le interazioni ospite-patogeno. I batteri patogeni secernono composti che inducono la mortalità dei vermi.
Confrontare la mortalità dei vermi per valutare l'effetto del knockdown gene-specifico sulla sopravvivenza dei vermi.
Aggiungere un millilitro di S Basal per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente 300 vermi per pozzetto. Agitare delicatamente i vermi agitando la piastra, quindi trasferirli in una piastra vuota e sterile a 24 pozzetti.
Lascia che i vermi si stabiliscano gravitazionalmente, circa cinque minuti. Aspirare il surnatante, lasciando circa un millilitro per pozzetto, quindi aggiungere 7 millilitri di S Basal a ciascun pozzetto. Ripetere il lavaggio altre due volte, quindi dopo il lavaggio finale aspirare tutti i microlitri di surnatante tranne circa 400.
Dopo aver pipettato i batteri in piastre da 384 pozzetti per evitare la fame, utilizzando la funzione di ricampionamento del selezionatore di vermi, smistare 22 vermi in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti. Infine, dopo la cernita, aggiungere piccole molecole o altri materiali specifici per l'esperimento.