JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:29 min. • September 26th, 2025
Inizia con una piastra contenente batteri che esprimono interferenza di RNA o RNAi pre-cresciuti.
Questi batteri trasportano plasmidi contenenti un gene di resistenza agli antibiotici e un inserto genico bersaglio che produce RNA a doppio filamento o dsRNA per inibire l'espressione genica specifica nell'ospite.
Utilizzando uno spillo sterile, trasferire le colonie in una piastra a pozzetti profondi contenente un terreno integrato con antibiotici.
Incubare la piastra con agitazione per una crescita batterica uniforme, dove i pozzetti profondi forniscono l'aerazione.
L'antibiotico elimina i batteri privi del plasmide, assicurando che sopravvivano solo i batteri portatori di plasmidi.
Centrifugare la piastra per separare i batteri ed eliminare il surnatante.
Risospendere i batteri in una soluzione salina tamponata per stabilizzarli.
Erogare i batteri risospesi in una piastra a più pozzetti contenente un terreno ricco di sostanze nutritive integrato con un antibiotico e un induttore.
L'antibiotico seleziona i batteri portatori di plasmidi, mentre l'induttore innesca l'espressione del dsRNA.
La piastra seminata con batteri che esprimono RNAi è pronta per ulteriori saggi.
Per testare più ceppi batterici di RNAi in parallelo in un singolo pozzetto di una piastra profonda 24 pozzetti, inoculare una singola colonia da ciascun clone di batteri contenenti RNAi precedentemente preparati in quattro millilitri di LB integrato con carbenicillina. Posizionare le piastre in un incubatore di agitazione ottimizzato per piastre multi-pozzetto a 37 gradi Celsius e 950 giri/min per 16 ore, Quindi raccogliere i batteri mediante centrifugazione a 2.000 g per 5 minuti. Decantare il surnatante capovolgendo la piastra e agitandola energicamente.
Utilizzando 100 microlitri di S Basal risospendere i batteri RNAi. Pipettare i batteri risospesi in un numero appropriato di pozzetti di una piastra NGM a più pozzetti integrata con IPTG e carbenicillina e lasciare asciugare la piastra.