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Inizia con una piastra microfluidica riempita con un mezzo nutritivo preriscaldato.
Fissare la piastra al sistema di collettori e sigillare l'installazione. Guidare il fluido attraverso i canali per rimuovere eventuali bolle d'aria.
Posizionare la configurazione su un tavolino da microscopio e preriscaldarla per evitare l'espansione della piastra durante l'imaging.
Quindi, rimuovere il terreno, introdurre una coltura batterica negli ingressi cellulari e un mezzo che induce stress negli ingressi della soluzione.
Il mezzo che induce lo stress contiene un antibiotico che arresta la divisione cellulare senza inibire l'aumento della massa cellulare.
Sigillare il sistema, quindi avviare il caricamento delle cellule per trasferire i batteri nella camera di coltura della piastra.
Utilizzando la luce trasmessa, individuare un campo visivo contenente singole celle distribuite uniformemente.
Iniettare nella camera il mezzo che induce lo stress per esporre le cellule all'antibiotico.
Utilizzando la modalità a contrasto di fase, è possibile acquisire immagini time-lapse per osservare la formazione di cellule filamentose allungate con un aumento del contenuto di DNA causato dall'inibizione della divisione cellulare mediata da antibiotici.
Innanzitutto, rimuovere la soluzione di conservazione dalla piastra microfluidica e sostituirla con un terreno fresco preriscaldato a 37 gradi Celsius come descritto nella Guida per l'utente del software Microfluidic. Fissare la piastra microfluidica al sistema del collettore.
E nel software microfluidico, fare clic sul pulsante Sigilla per sigillare la piastra al sistema del collettore. Successivamente, fai clic sul pulsante Priming. Posizionare la piastra microfluidica con il sistema di collettori sul tavolino del microscopio e preriscaldarla a 37 gradi Celsius per due ore per evitare la dilatazione della camera microfluidica.
Sigillare la piastra microfluidica sul sistema microfluidico facendo clic sul pulsante Seal Off. Sostituire il terreno del pozzetto otto con 150 microlitri di campione di coltura e sostituire il terreno dal pozzetto uno al pozzetto cinque con il terreno desiderato, con o senza il reagente che induce lo stress. Sigillare la piastra microfluidica e posizionarla sul tavolino del microscopio.
Nel software microfluidico, eseguire la procedura di caricamento della cella. Verificare che il carico delle celle sia soddisfacente guardando al microscopio in luce trasmessa. Mettere a fuoco con attenzione in modalità a luce trasmessa e selezionare diversi campi visivi che mostrino batteri isolati e non siano sovraffollati, da 10 a 20 cellule per 100 microlitri quadrati.
Nel software microfluidico, fare clic sul pulsante Esegui una sequenza personalizzata, quindi programmare l'iniezione del mezzo che induce stress per 10 minuti a due PSI, seguita dall'iniezione a un PSI per la durata desiderata del trattamento di stress. Eseguire l'imaging al microscopio in modalità time-lapse con un fotogramma ogni 10 minuti, utilizzando il contrasto di fase in luce trasmessa e una sorgente luminosa di eccitazione a 560 nanometri per il segnale mCherry, se necessario. Avviare contemporaneamente l'acquisizione dell'immagine microscopica e il protocollo di iniezione microfluidica.