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Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:27 min • September 26th, 2025
Inizia con una coltura di E. coli pretrattata con un antibiotico.
Questo antibiotico blocca la divisione cellulare, con conseguente formazione di cellule filamentose allungate con un aumento del contenuto di DNA.
Impiattare una parte della coltura su una piastra di agar ricca di sostanze nutritive e incubare.
Le cellule filamentose non si dividono nonostante la crescita continua; Solo le cellule non filamentose formano colonie, con conseguente basso numero di colonie.
Diluire la coltura batterica rimanente e aggiungere un colorante fluorescente legante il DNA. Quindi, incubare al buio.
Il colorante entra nelle cellule e si lega al DNA.
Agitare il campione e poi farlo passare attraverso un citometro a flusso.
La quantità di luce diffusa da ogni cella corrisponde alla sua dimensione.
Allo stesso modo, la fluorescenza emessa dagli acidi nucleici legati al colorante indica il contenuto di DNA batterico.
Le cellule trattate con antibiotici mostrano un aumento della dispersione e della fluorescenza, che riflette la crescita filamentosa e la continua replicazione del DNA senza divisione.
Ciò dimostra le modifiche nella fisiologia batterica causate dagli antibiotici che inibiscono la divisione cellulare.
Preparare diluizioni seriali di dieci volte, fino a 10 fino a meno settimo, dei 200 microlitri di campione di coltura in terreno fresco.
Mescolare tra una diluizione e l'altra con un vortice molto delicato o capovolgendo il tubo. Piastra 100 microlitri della diluizione appropriata su piastre di agarosio LB non selezionate e incuba per una notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, contare il numero di colonie per determinare la concentrazione di cellule vitali in ciascun campione di coltura.
Tracciare le CFU per millilitro in funzione del tempo per le colture cellulari non trattate e trattate. Misurare il diametro esterno 600 della coltura su uno spettrofotometro. Diluire il campione di coltura con terreno fresco a quattro gradi Celsius per ottenere un campione con OD 600 a 0,06, corrispondente a circa 15.000 cellule per microlitro.
Per la colorazione del DNA, mescolare il campione batterico diluito con una soluzione da 10 microgrammi per millilitro di colorante fluorescente al DNA in un rapporto di volume di uno a uno e incubare al buio per 15 minuti. Prima dell'iniezione del campione, miscelare il campione con un vortice molto delicato o capovolgendo il tubo. Passare il campione nel citometro a flusso a una velocità di flusso di circa 120.000 cellule al minuto.
Acquisisci la luce diffusa in avanti e lateralmente, nonché il colorante fluorescente al DNA/il segnale fluorescente con le impostazioni appropriate.