Rilevamento colorimetrico della degradazione della corteccia durante la germinazione delle spore batteriche

0 visualizzazioni3:05 min • September 26th, 2025

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Una spora batterica rimane dormiente a causa di uno strato di corteccia peptidoglicano, un polimero di zuccheri e aminoacidi.

Durante la germinazione, la corteccia si degrada per rilasciare zuccheri nel mezzo circostante.

Per rilevare la degradazione della corteccia, iniziare con il terreno contenente gli zuccheri rilasciati, raccolti in punti temporali definiti durante la germinazione delle spore.

Utilizzare concentrazioni crescenti di standard di zucchero come riferimento.

Gli standard e i campioni sono stati sottoposti a un trattamento preliminare per convertire gli zuccheri in una forma reattiva.

Incubare con il reagente di Ehrlich, un reagente di rilevamento colorimetrico che reagisce con gli zuccheri e forma un complesso di colore viola.

Trasferire le miscele su una piastra multipozzetto e misurare l'assorbanza dei complessi colorati utilizzando un lettore di micropiastre.

L'assorbanza corrisponde all'intensità del colore violaceo, che è direttamente proporzionale alla concentrazione di zucchero.

Un aumento dell'assorbanza tra i campioni di punti temporali indica una progressiva degradazione della corteccia.

Genera un grafico dalle concentrazioni standard e quantifica le concentrazioni del campione.

Mentre i campioni sono in ghiaccio, preparare il reagente colorante. Sciogliere 0,320 grammi di DMAB in 1,9 millilitri di acido acetico glaciale. Si noti che questo reagente è sensibile al tempo, alla temperatura e alla luce e non deve essere preparato in anticipo.

Dopo che il DMAB si è completamente sciolto, aggiungere 100 microlitri di acido cloridrico normale 10 e agitare il campione. Quindi aggiungere cinque millilitri di acido acetico glaciale e vorticare di nuovo. Per la reazione colorimetrica, trasferire 100 microlitri di ciascuna corteccia raffreddata o campione di controllo in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Aggiungere 700 microlitri della soluzione colorante appena preparata a ciascun campione. Trasferire immediatamente i campioni in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e incubare i campioni per 20 minuti esatti. Dopo l'incubazione, trasferire 200 microlitri di ciascun campione in una piastra trasparente a 96 pozzetti.

I campioni dovrebbero essere di colore giallo all'inizio, ma passeranno al viola se è presente lo zucchero riducente, che indica la presenza di corteccia. Qui, molti dei campioni non mostrano un colore viola visibile. Tuttavia, i campioni di 250, 500 e 5.000 nanomoli appaiono visivamente diversi dal controllo negativo zero nanomole.

Utilizzando un lettore di piastre, determinare l'assorbanza a 585 nanometri. Se misurato in un diametro esterno di 585 nanometri, il segnale generato dai campioni standard si adatta meglio a una regressione lineare.

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Ultimo aggiornamento: 1 agosto 2026