Produzione e recupero di proteine ricombinanti da vescicole derivate da batteri

Inizia con una coltura di una specie batterica che codifica proteine ricombinanti marcate con il peptide nucleante della vescicola, o VNp, un peptide corto che promuove la formazione di vescicole.

Aggiungi un induttore alla coltura e incuba. L'induttore innesca l'espressione proteica.

VNp si incorpora nella membrana interna e promuove la curvatura della membrana, incapsulando le proteine marcate con VNp nelle vescicole in gemmazione.

Trasferire il terreno ricco di vescicole in un tubo. Centrifugarlo per separare il surnatante ricco di vescicole.

Quindi, filtrare il surnatante per rimuovere i contaminanti residui.

Quindi, far passare il filtrato attraverso un altro filtro a membrana per catturare le vescicole sulla superficie della membrana.

Mettere la membrana in un piatto e aggiungere soluzione salina tamponata con fosfato.

Staccare delicatamente le vescicole e trasferire la sospensione in un tubo pulito.

Sonicare la sospensione per distruggere le membrane delle vescicole e rilasciare le proteine.

Centrifugare il lisato per separare i frammenti di membrana.

Il surnatante risultante contiene proteine ricombinanti purificate, pronte per l'analisi.

Indurre l'espressione della proteina ricombinante dal promotore T7 aggiungendo IPTG a una concentrazione finale fino a 20 microgrammi per millilitro, o 84 micromolari. Dopo aver concesso un tempo sufficiente per l'induzione, pellettare le celle mediante centrifugazione a 3000 g e 4 gradi Celsius per 20 minuti. Passare il surnatante attraverso un filtro PES da 0,45 micron sterile e privo di detergenti per sterilizzare la vescicola contenente il terreno per la conservazione a lungo termine.

Per concentrare le vescicole in un volume più piccolo, passare il terreno contenente vescicole sterili attraverso un filtro MCE da 0,1 micron sterile e privo di detergenti. Quindi, lavare delicatamente la membrana con 0,5-1 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato sterile, o PBS, e utilizzare un raschietto cellulare o uno spalmatore di plastica per rimuovere con cura le vescicole dalla membrana. Trasferire il concentrato di vescicola in una nuova provetta da microcentrifuga utilizzando una pipetta.

Le vescicole purificate possono essere conservate a 4 gradi Celsius. Sonicare le proteine contenenti vescicole nel terreno sterile utilizzando un programma appropriato per interrompere le membrane lipidiche vescicolari e rilasciare le proteine. Centrifugare la sospensione sonicata a 39.000 g e 4 gradi Celsius per 20 minuti per rimuovere i detriti vescicolari.