Inattivazione dei batteri mediante mononucleotide flavina attivato dalla luce

Inizia inoculando un batterio patogeno in una provetta contenente un mezzo liquido.

Incubare per favorire la proliferazione batterica, quindi trasferire la coltura in provette fresche.

Centrifugare le celle in pellet e scartare il surnatante.

Risospendere i pellet batterici in soluzioni tampone contenenti concentrazioni crescenti di flavina mononucleotide (FMN), un fotosensibilizzante e una soluzione tampone senza FMN per fungere da controllo.

Mescolare accuratamente il contenuto del tubo e trasferire le sospensioni in tubi di vetro.

Esporre i tubi alla luce visibile per fotoattivare l'FMN, che reagisce con l'ossigeno molecolare per generare specie reattive dell'ossigeno (ROS).

I ROS danneggiano i componenti cellulari batterici, riducendo così la vitalità batterica.

Trasferire le aliquote del campione su un terreno solido, distribuirle uniformemente e incubare per consentire ai batteri vitali sopravvissuti di crescere in colonie.

Post-incubazione, quantificare le colonie e calcolare la percentuale di riduzione della vitalità batterica rispetto al controllo per valutare l'effetto dose-dipendente della FMN.

Inoculare una colonia di Staphylococcus aureus in 10 millilitri di brodo di lisogenia in una provetta da 15 millilitri con tappo a vite. Coltiva la coltura a 37 gradi Celsius per 16 ore in uno shaker. Trasferire 0,5 millilitri di coltura in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri.

Diluire la coltura a una densità ottica di 0,5 a 600 nanometri aggiungendo acqua sterilizzata. Quindi, trasferire 0,5 millilitri di coltura in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare a 14.000 g per 10 minuti e decantare il surnatante.

Aggiungere un millilitro di soluzione tamponata FMN al pellet cellulare e al vortice. Per il controllo irradiato, aggiungere un millilitro di tampone fosfato. Trasferire un millilitro di soluzione di cellule batteriche contenente FMN 30-micromolare e tampone fosfato in provette di vetro.

Posizionali per una radiazione sotto la luce viola a 10 watt per metro quadrato per 30 minuti. Quindi, trasferire un millilitro di soluzione di cellule batteriche contenente 30, 60 e 120 micromolari FMN e tampone fosfato in provette di vetro. Irradiare con luce blu per 120 minuti a 20 watt per metro quadrato.

Inoltre, irradiare una provetta contenente un millilitro di FMN da 120 micromolari per 60 minuti. Dopo l'irradiazione, aggiungere 0,2 millilitri della soluzione di reazione su una piastra di luria agar. Stendere la soluzione utilizzando una bacchetta di vetro a forma di L e incubare per una notte a 37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, calcolare la conta vitale su piastra e il tasso di inattivazione di Staphylococcus aureus.