Quantificazione dell'inattivazione batterica indotta dalla luce attraverso la generazione di specie reattive dell'ossigeno

Iniziare con una miscela di reazione tamponata contenente L-metionina, un donatore di elettroni, nitro blu tetrazolio o NBT, un indicatore redox, e flavina mononucleotide o FMN, un fotosensibilizzante.

Aggiungere questa miscela in un tubo contenente il pellet batterico e il vortice.

Trasferire la soluzione in una provetta di vetro.

Ora, irradiare la miscela con luce viola per attivare FMN, che accetta un elettrone dalla L-metionina, formando un intermedio reattivo.

Questo intermedio trasferisce l'elettrone all'ossigeno molecolare disciolto, generando specie reattive dell'ossigeno o ROS vicino alla superficie batterica.

I ROS risultanti danneggiano i componenti cellulari e riducono la vitalità batterica.

Il ROS riduce anche l'NBT a formazano, un prodotto di colore blu che si deposita vicino alla superficie batterica.

Trasferire il composto in una provetta, centrifugarlo ed eliminare il surnatante.

Risospendere il pellet in un solvente organico per solubilizzare il formazano.

Infine, misurare l'assorbanza per determinare l'inattivazione batterica indotta dalla luce attraverso la generazione di ROS.

Preparare i campioni di Staphylococcus aureus come descritto in precedenza per ottenere un pellet cellulare. A 75 millilitri di tampone fosfato aggiungere 0,1093 grammi di L-metionina, 0,1 grammi di NBT e 25 millilitri di soluzione FMN.

Aggiungere un millilitro di ciascuna soluzione reagente con concentrazioni variabili di FMN ai pellet cellulari e al vortice. Irradiare le soluzioni sotto luce viola a 10 watt per metro quadrato per 10 minuti. Centrifugare la miscela a 14.000 g per 10 minuti e decantare il surnatante.

Risospendere il pellet in un millilitro di dimetilsolfossido per estrarre l'NBT ridotto. Registrare l'assorbanza a 560 nanometri.