Name: Le registrazioni elettrofisiologiche dal Percorso di Fiber Gigante D. melanogaster /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Impara a registrare i potenziali postsinaptici nei muscoli DLM e TTM di Drosophila melanogaster per studiare la trasmissione sinaptica nel sistema delle fibre giganti. Questo metodo elettrofisiologico consente di analizzare le proprietà funzionali dei circuiti neuronali.

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1. Attrezzature e materiali <ol><li> Questi esperimenti utilizzare una configurazione standard elettrofisiologia composto da uno stimolatore, una unità di isolamento stimolo, due amplificatori microelettrodo, un sistema di acquisizione dati e un computer con software di raccolta. Le apparecchiature aggiuntive comprendono una gabbia di Faraday, uno stereomicroscopio su un supporto braccio, un tavolo isolamento dalle vibrazioni, una fonte di luce, e una piattaforma di registrazione. </li><li> Cinque micromanipolatori vengono utilizzati. Due micromanipolatori richiedono controlli bene per il posizionamento degli elettrodi di registrazione, mentre gli altri tre micromanipolatori richiedono solo controlli lordo per posizionare i due elettrodi di stimolazione e l'elettrodo di massa. Il micromanipolatore per l'elettrodo di registrazione DLM è posto alla fine della coda della preparazione (a sinistra di sperimentatore) e il micromanipolatore per l'elettrodo di registrazione TTM è posto tra lo sperimentatore e il lato della preparazione (leggermente a sinistra dello sperimentatore). I due micromanipolatori che conterrà gli elettrodi di simulazione sono posti a capo della preparazione (diritto di sperimentatore). Il micromanipolatore per l'elettrodo di terra è posto al lato opposto della preparazione </li><li> Tirare microelettrodi registrazione di vetro con resistenze di 40-60 MΩ e memorizzare appartamento in un piatto sostenuto da cera. Per la stimolazione, due elettrodi di tungsteno elettroliticamente (NaOH) affilato vengono utilizzati. Un filo di tungsteno, o di un terzo elettrodo elettroliticamente fabbricato viene utilizzato come terreno. Gli elettrodi stimolanti e terra sono preparati e attaccato al micromanipolatori prima dell'inizio della sessione sperimentale e non deve essere sostituito per tutta la durata della sessione. </li></ol> 2. Preparazione del D. melanogaster <ol><li> Una volta che la vostra attrezzatura è impostato, è il momento di preparare le mosche. Anestetizzare le mosche da raffreddamento su di loro o utilizzando ghiaccio di CO 2. Se la CO 2 viene utilizzata, il tempo sufficiente (circa 20 minuti) per gli effetti del gas a svanire prima di iniziare l'esperimento. </li><li> Usare pinze per trasferire le mosche con delicatezza per le zampe ad un piatto contenente una piattaforma di cera morbida inclinata con un angolo di circa 45 °. I prossimi quattro passi si fanno sotto un microscopio da dissezione lontano da (ma vicino a) l'apparecchio di controllo. </li><li> Il passo successivo è quello di garantire al volo in cera. Orientare il lato ventrale volare verso il basso, con il suo anteriore rivolta verso l'alto sul pendio. Usando un paio di pinze fine, estendere le gambe verso l'esterno, a coppie, e spingerli nella cera. </li><li> Familiarizzare con la posizione dei muscoli da registrare da: il muscolo dorsale longitudinale, o DLM, e il muscolo tergotrochanteral, o TTM. I siti attaccamento intradermica della DLMS corrispondono con la regione tra la linea mediana del torace e la dorsale anteriore setole (o setae). I siti attaccamento TTM si trovano dorsalmente del posteriore e anteriore sovra-alari setole. Fare in modo che le ali non ostruire l'accesso alle fibre DLM o TTM, tenere le ali verso l'esterno e 'colla' a la cera. </li><li> Utilizzando un bel paio di pinze, tirare la proboscide verso l'esterno con attenzione, e fissarlo immergendolo nella cera. Questo è un passo fondamentale che richiede una certa pratica in quanto la proboscide è morbido ed è facilmente staccato dal resto della testa. Se ciò accade, scartare il volo e ricominciare. Il mancato per fissare la testa in questo modo porta a problemi durante l'inserimento degli elettrodi stimola attraverso gli occhi. </li></ol> 3. Posizionamento degli elettrodi <ol><li> Una volta che la mosca è ancorata alla cera, trasferire il piatto con la mosca allegato sotto lo stereomicroscopio, che si trova all'interno della gabbia di Faraday. Orientare il volo lateralmente con la testa della mosca a destra dello sperimentatore. </li><li> Il passo successivo è quello di inserire gli elettrodi. Elettrodi di massa e stimolante può essere inserito senza guardare nel microscopio. Buone registrazioni si basano su palo preciso, quindi è una buona idea di praticare la manipolazione del micromanipolatori. Portare gli elettrodi vicino ai siti di inserimento con l'aiuto di micromanipolatori per facilitare la loro collocazione corretta e registrazioni successive. </li><li> Abbassare l'elettrodo di terra nella estremità posteriore dell'addome con le ruote di regolazione del micromanipolatore. Per posizionare gli elettrodi di tungsteno affilato stimolante a livello cerebrale, utilizzare il micromanipolatore per posizionare la punta di uno degli elettrodi in modo che tocchi solo uno degli occhi di mosca. Fate lo stesso con l'altra in modo che entrambi gli elettrodi sono solo toccando l'esterno di ogni occhio. Quindi spingere gli elettrodi, a loro volta, attraverso ogni occhio così le punte degli elettrodi raggiungere il cervello situata nella parte posteriore della capsula testa (circa 2-3mm). </li><li> Elettrodi posizionati correttamente si attiverà il sistema di Gigante fibra. Per verificare che gli elettrodi stimolanti sono posizionati correttamente, applicare un corto (0,03 ms) Stimolo di 30-60 V attraverso gli elettrodi stimolanti, e cercare il movimento delle ali e contrazioni del volo / gamba muscolare ' </li><li> Il passo successivo è quello di back-riempire il bicchiere con microelettrodi 3M KCl con un Hamilton o calore tirato siringa di plastica, e metterli nel fine controllo micromanipolatori. Microelettrodi inseriti correttamente può essere utilizzata per diversi round di esperimenti. </li><li> L'elettrodo prima registrazione verrà inserito in una fibra DLM. Ci sono due DLMS simmetria bilaterale, ognuno è composto da sei singole fibre muscolari. Le registrazioni possono essere fatto da uno dei sei fibre, ma il più comunemente usati sono fibre DLM 45 bis e 45 ter per la loro buona accessibilità attraverso il lato dorsale della cuticola toracica, e il fatto che sia le fibre sono innervati dal motorneuron same . </li><li> Utilizzando il micromanipolatore sul lato più lontano da te, inserire un elettrodo di registrazione in fibra DLM 45 bis o b. La pendenza della piattaforma consente l'elettrodo DLM per entrare nella cuticola dorsale ad un angolo di ~ 60-90 °, che aiuta la penetrazione. Utilizzare il software in modalità oscilloscopio e guardare il monitor del computer mentre l'inserimento di elettrodi di registrazione nel torace. Quando l'elettrodo è entrato un muscolo la linea di base scenderà quasi a zero o un valore negativo. Prova con un singolo stimolo per vedere se è possibile osservare la risposta del muscolo. </li><li> Inserire l'altro elettrodo di registrazione nel TTM più vicino a voi. Questo elettrodo viene inserito lateralmente, di fronte a voi, a causa della posizione del sito di inserzione del muscolo. Anche in questo caso osservare il monitor mentre si fa questo e prova con un singolo stimolo una volta che la traccia indica l'elettrodo è nel muscolo. </li></ol> 4. Stimolazione e registrazione <ol><li> Ora siete pronti per iniziare a stimolare il cervello e le risposte registrazione dalla muscoli di gambe e di volo. Applicare una breve (0,03 ms) stimolo attraverso gli elettrodi stimolante a partire da 30 V e di aumentare a 60 V fino a quando si osserva una risposta (cioè una contrazione muscolare, e una depolarizzazione delle cellule muscolari come osservato sul monitor del computer). Per il resto l'esperimento, riportare la tensione V 5-10 al di sopra della soglia di risposta. </li><li> Per misurare la latenza di risposta, dare almeno 5 stimoli singoli con un periodo di 5 secondo riposo tra ogni stimolo. </li><li> Determinare la "frequenza di seguire" fornendo i treni di stimoli a velocità diverse. Tipicamente 10 treni su 10 stimoli sono date a 100 Hz (10 ms tra ogni stimolo), 200Hz (5 ms tra ogni stimolo) e 300Hz (3 ms tra ogni stimolo). Consentire un periodo di riposo di 2 secondi tra ogni treno di stimoli. </li></ol> 5. Risultati: latenze di risposta in frequenza e di seguito nella via fibra Gigante <ol><li> La latenza di risposta è il tempo che intercorre tra la stimolazione del cervello e depolarizzazione del muscolo. Questa cifra si confronta le latenze di risposta per DLM e TTM ad un singolo stimolo. Latenze tra 0,7 e 1,2 ms per il GF-TTM percorso e tra 1,3 e 1,7 ms per il GF-DLM percorso indicano una preparazione tecnica di registrazione sana e corretta. Le latenze può variare con genotipo, background genetico, la temperatura e l'età. Figura 1 (A e B). Rappresentante tracce presentano risultati registrati dal TTMs e DLMS a seguito di un singolo stimolo applicato al cervello. </li><li> Come mostrato qui, registrazioni dal TTM mostrano una maggiore variabilità in termini di ampiezza e la forma del potenziale postsinaptico (PSP) rispetto a quelli delle fibre di DLM di grandi dimensioni; questa maggiore variabilità è dovuta alle piccole dimensioni delle fibre muscolari TTM. Questa variabilità, tuttavia, non influenza i valori di latenza di risposta per il gigante Fiber-to-TTM percorso. Figura 1 (C e D). Aggiuntive 'latenza di risposta' tracce da 4 mosche individuale sia per il TTM e DLM. Nota TTM variabilità presentano tracce di forma PSP ma la latenza di risposta non è influenzato. Per DLM c'è meno variabilità di forma PSP. <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig1.jpg" alt="Figura 1 A-D" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1-D"> </li><li> Confrontare la "frequenza di seguire" a 100 Hz, 200 Hz e 300 Hz calcolando la percentuale di risposte efficaci (su 10) sia per DLM e percorsi TTM ad ogni frequenza di stimolazione. A 100 Hz, sia TTM e DLM seguire le 01:01 stimoli. A frequenze di stimolazione superiori a 100 Hz, le risposte DLM iniziano a mostrare fallimenti perché la sinapsi chimica intermediario tra due interneuroni non ha tempo sufficiente per recuperare tra stimoli. Le risposte TTM, tuttavia, restano 1:1 con stimoli anche oltre 300Hz. Figura 2. Tracce Rappresentante mostra la "frequenza di seguire" le registrazioni. A 100Hz, sia TTMs e DLMS rispondere a tutti i 10 stimoli (a sinistra). A 200Hz, le risposte DLM iniziare a fallire (asterisco). <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> </li></ol> 6. Rappresentante Risultati Wild type breve latenza risposte (elettrodi stimolati sono posti negli occhi, bypassando i recettori sensoriali e innescando il circuito GF direttamente) dipendono da genotipo, background genetico, la temperatura e l'età, e la gamma tra 0,7 e 1,2 ms per il GF-TTM percorso e and1.7 1,3 ms per il GF-DLM percorso (Tanouye e Wyman, 1980; Thomas e Wyman, 1984; Engel e Wu, 1992; Allen e Murphey, 2007; Phelan et al, 2008;. Agostino et al, non pubblicata.) . Questa latenza TTM molto brevi è dovuta alla robusta GF-TTMn sinapsi elettrochimica del percorso monosinaptico e la latenza più DLM si verifica a causa della natura disynaptic della via così come la presenza di una sinapsi chimica (PSI-DLMn). Intermedia e lunga latenza delle risposte (&gt; 3 ms) derivare dalla attivazione delle afferenze GF e sono realizzati mediante l'utilizzo di una stimolazione minore intensità o fornire un controllo visivo ("light-off") del segnale. A 100Hz sia TTM e DLM dovrebbe seguire gli stimoli 1:1. Sopra 100Hz risposte DLM inizierà a mostrare fallimenti come la sinapsi chimica tra PSI e il DLMns non ha tempo sufficiente per recuperare tra stimoli meno di 10ms a parte. Risposte TTM, comunque, rimarrà 1:1 con stimoli anche al di là 300Hz (Tanouye e Wyman, 1980; Engel e Wu, 1992;. Allen et al, 2007;. Martinez et al, 2007). Le mutazioni nel gene shakB, che codifica per una Drosophila divario di giunzione canale ("innexin"), un aumento significativo della latenza di risposta del GF-TTM percorso (~ 1,5 ms) mentre il GF-DLM ramo non risponde (Allen e Murphey, 2007; Phelan et al., 2008). La risposta mutante può essere ripristinata attraverso la stimolazione dei gangli toracici direttamente, a dimostrazione che l'effetto ritardato non è dovuto a interrotto la trasmissione neuromuscolare. La capacità di seguire la stimolazione ad alta frequenza è alterata in questi mutanti rispetto ai wild-type vola dove il GF-DLM e GF-TTM percorsi sono generalmente in grado di seguire 10 stimoli con rapporto 1:1 fino a 100 Hz e 300 Hz rispettivamente. E 'importante notare che queste frequenze sono notevolmente al di sopra frequenze di stimolazione normale ricevuto dal contrazione dei muscoli durante il volo prolungato (3-10 Hz) (Hummon e Costello, 1989). Un altro parametro utilizzato per descrivere la stabilità delle uscite GFS è il "periodo refrattario", ovvero il tempo minimo tra gli impulsi stimolo gemello che produce ancora due risposte dal muscolo. Il tempo refrattario varia tra i 1-4 ms per TTMs ei 7-15 ms per DLMS. Il periodo relativamente lungo refrattari per DLMS è dovuto alla relativamente labile sinapsi chimica al PSI-DLMn giunzione (Tanouye e Wyman, 1980; Gorczyca e Hall, 1984; Engel e Wu, 1992; Banerjee et al, 2004;. Allen e Godenschwege, 2010).

<ol><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. Electrophysiological Recordings from the Drosophila Giant Fiber System. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAllen%2C+MJ+%22Drosophila+Neurobiology%3A+A+Laboratory+Manual%22">Drosophila Neurobiology: A Laboratory Manual</a>. Zhang, B., Freeman, M. R., Wadde, S. , 1st Lab ed, Cold Spring Harbor Press. (2010).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+an+escape%3A+development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin Cell Dev Biol. 17, 31-41 (2006).</li>
<li>Allen, M. J., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+component+of+the+mixed+GF-TTMn+synapse+in+Drosophila+melanogaster+uses+acetylcholine+as+its+neurotransmitter%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter.</a> Eur J Neurosci. 26, 439-445 (2007).</li>
<li>Banerjee, S., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+flight+and+associated+neuronal+rhythmicity+in+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptor+mutants+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of flight and associated neuronal rhythmicity in inositol 1,4,5-trisphosphate receptor mutants of Drosophila.</a> J Neurosci. 24, 7869-7878 (2004).</li>
<li>Engel, J. E., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+membrane+excitability+mutations+affecting+potassium+and+sodium+currents+in+the+flight+and+giant+fiber+escape+systems+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Interactions of membrane excitability mutations affecting potassium and sodium currents in the flight and giant fiber escape systems of Drosophila.</a> J Comp Physiol A. 171, 93-104 (1992).</li>
<li>Gorczyca, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cholinergic+synapse+in+the+giant+fiber+pathway+of+Drosophila+using+conditional+mutations+of+acetylcholine+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis.</a> J Neurogenet. 1, 289-313 (1984).</li>
<li>Hummon, M. R., Costello, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+fiber+activation+of+flight+muscles+in+Drosophila%3A+asynchrony+in+latency+of+wing+depressor+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Giant fiber activation of flight muscles in Drosophila: asynchrony in latency of wing depressor fibers.</a> J Neurobiol. 20, 593-602 (1989).</li>
<li>Jacobs, K., Todman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptogenesis+in+the+giant-fibre+system+of+Drosophila%3A+interaction+of+the+giant+fibre+and+its+major+motorneuronal+target%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Synaptogenesis in the giant-fibre system of Drosophila: interaction of the giant fibre and its major motorneuronal target.</a> Development. 127, 5203-5212 (2000).</li>
<li>King, D. G., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+giant+fibre+pathway+in+Drosophila.+I.+Three+thoracic+components+of+the+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the giant fibre pathway in Drosophila. I. Three thoracic components of the pathway.</a> J Neurocytol. 9, 753-770 (1980).</li>
<li>Martinez, V. G., Javadi, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+climbing+behavior+and+neural+circuit+physiology+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in climbing behavior and neural circuit physiology in Drosophila.</a> Dev Neurobiol. 67, 778-791 (2007).</li>
<li>Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+A+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. Demerec, M. , 2nd, Hafner. New York. 502-503 (1965).</li>
<li>Phelan, P., Goulding, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+rectification+at+identified+electrical+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of rectification at identified electrical synapses in the Drosophila giant fiber system.</a> Curr Biol. 18, 1955-1960 (2008).</li>
<li>Power, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thoracico-abdominal+nervous+system+of+an+adult+insect%2C+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect, Drosophila melanogaster.</a> J Comp Neurol. 88, 347-409 (1948).</li>
<li>Tanouye, M. A., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+outputs+of+giant+nerve+fiber+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila.</a> J Neurophysiol. 44, 405-421 (1980).</li>
<li>Thomas, J. B., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+altering+synaptic+connectivity+between+identified+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila.</a> J Neurosci. 4, 530-538 (1984).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Una delle cose più importanti si deve prestare attenzione quando si cerca di ottenere registrazioni di alta qualità è il giusto orientamento e la salute della preparazione. Idealmente, il volo dovrebbe essere ancora vivo alla fine della sessione di registrazione e reattivo agli stimoli elettrici. Per gli elettrodi di registrazione per penetrare in modo più efficiente l&#39;esoscheletro toracica, il volo deve essere incollata alla superficie in modo da formare un angolo retto con gli elettrodi, se necessario, l&#39;inserimento di elettrodi può essere facilitato dalla rimozione di una porzione del dorsal cuticola thoracic con uno scalpello tungsteno esponendo così le muscle DLM volo (questo passo offre un ulteriore vantaggio di rendere più difficile per le punte degli elettrodi di vetro per rottura). Inoltre, la cura deve essere presa per evitare di spingere gli elettrodi attraverso i DLMS subcuticularly trova e TTMs. La testa della mosca deve essere ben assicurato per consentire la elettrodi stimolanti per essere adeguatamente inserito nel cervello e di impedire loro di essere tirato fuori durante la sessione di registrazione. Grazie alle sue dimensioni e ben descritta la morfologia, la GFS rappresenta uno dei percorsi più accessibili neuronali in Drosophila. La permeabilità delle sinapsi elettriche ai coloranti piccolo peso molecolare tracciante permette la visualizzazione dei neuroni elettricamente accoppiati, e diverse linee GAL4 disponibili consentono di manipolare i livelli di espressione genica in un sottogruppo di cellule o gruppi di cellule (Jacobs et al, 2000;. Allen et al., 2006) In aggiunta ai vantaggi di cui sopra, sia i componenti afferenti ed toracica di proprietà di visualizzazione del circuito, come abitudine, il recupero spontaneo e dishabituation, rendendo la GFS Drosophila un sistema modello ideale per studiare la plasticità neuronale (Engel e Wu, 1996).

<table border="1"><tbody><tr><td> NOME </td><td> AZIENDA </td><td> CAT. # </td><td> COMMENTI </td></tr><tr><td> S48 Piazza impulsi dello stimolatore </td><td> Erba Instruments </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> Stimolazione unità </td><td> Erba Instruments </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> SIU5 RF trasformatore di isolamento Unità </td><td> Erba Instruments </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> 5A a due canali Amplificatore microelettrodi intracellulari </td><td> Come Instruments </td><td></td><td> http://www.gettinginstruments.com/ </td></tr><tr><td> Digidata 1440A sistema di acquisizione dati </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td> Analogico-digitale Digidata 1320 e Axoscope software 9,0 </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td> Piattaforma di registrazione con micromanipolatori manuale </td><td> Narishige, Sutter Ins., Mondo precisione Ins. </td><td></td><td> http://narishige-group.com/ http://www.sutter.com/index.html http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td> Sorgente di luce </td><td> Fostec </td><td></td><td> http://www.nuhsbaum.com/FOSTEC.htm </td></tr><tr><td> Selvatico M5 stereomicroscopio </td><td> Selvatico Heerbrugg </td><td></td><td> http://www.wild-heerbrugg.com/ </td></tr><tr><td> Isolamento dalle vibrazioni tavolo </td><td> TMC </td><td></td><td> http://www.techmfg.com/ </td></tr><tr><td> Tubi borosilicato per microelettrodi </td><td> Sutter strumento </td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> P-95 Micropipetta estrattore </td><td> Sutter strumento </td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> Microfil calibro 34, 67 mm (filler elettrodo) </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> MF34G-5 </td><td> http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td> Strumenti di microdissezione (pinze, ...) </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td></td><td> www.finescience.com </td></tr><tr><td> Dissezione (stereo) microscopio </td><td> Leica </td><td></td><td> http://www.leica-microsystems.com/ </td></tr><tr><td> Gabbia di Faraday </td><td> Produttore sconosciuto </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Altro: siringhe di plastica, terra filo di tungsteno e NaOH affilate elettrodi di tungsteno, KCl, piattaforma di cera, un PC con monitor ...

le registrazioni elettrofisiologiche dal percorso di fiber gigante d. melanogaster</em

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Quando spaventato adulto D. melanogaster reagire saltando in aria e volare via. In molte specie di invertebrati, tra cui D. melanogaster, la &quot;fuga&quot; (o &quot;spaventare&quot;) risposta durante la fase adulta è mediato dal multi-componente del circuito neuronale chiamato Sistema fibra Gigante (GFS). La dimensione comparativa di grandi dimensioni dei neuroni, la loro particolare morfologia e connettività semplice rendere il modello GFS un sistema interessante per lo studio di circuiti neuronali. Il percorso GFS è composto da due simmetria bilaterale gigante Fibra (GF) interneuroni cui assoni scendono dal cervello lungo la linea mediana nel ganglio toracico tramite il connettivo cervicale. Nel neuromere mesothoracic (T2) dei gangli ventrali forma GF elettro-chimica delle sinapsi con 1) il dendrite grande mediale della motorneuron ipsilaterale (TTMn) che aziona il muscolo tergotrochanteral (TTM), l&#39;estensore principale per il femore mesothoracic / gamba , e 2) controlaterale interneurone perifericamente sinapsi (PSI), che a loro volta forme chimiche (colinergici) sinapsi con i motoneuroni (DLMns) dei muscoli dorsali longitudinali (DLMS), l&#39;ala depressori. Il percorso neuronale (s) ai muscoli dorsovental (DVMS), gli ascensori ala, non è stato ancora elaborato (il DLMS e DVMS sono noti congiuntamente come i muscoli di volo indiretto - che non sono collegati direttamente alle ali, ma piuttosto spostare l&#39; ali indirettamente distorcendo la cuticola vicina toracica) (King e Wyman, 1980;. Allen et al, 2006). Il di-sinaptica attivazione del DLMS (via PSI) causa un ritardo piccolo ma importante nel momento della contrazione di questi muscoli relativi alla attivazione monosinaptico di TTM (~ 0,5 ms), permettendo di estendere TTMs prima del femore e spingere il volare da terra. Il TTMs contemporaneamente stiro-attivare il DLMS che a sua volta tratto reciprocamente-attivare il DVMS per tutta la durata del volo. Il percorso GF può essere attivato sia indirettamente applicando una sensoriale (ad esempio &quot;air-puff&quot; o &quot;luci-off&quot;) stimolo, o direttamente da un sovra-soglia di stimolo elettrico al cervello (descritto qui). In entrambi i casi, un potenziale d&#39;azione raggiunge il TTMs e DLMS solo attraverso il GF, SIPS, e TTM / DLM motoneuroni, anche se la TTMns e DLMns hanno altre, non ancora identificato, input sensoriali. Misura &quot;risposta latenza&quot; (il tempo che intercorre tra la stimolazione e la depolarizzazione del muscolo) e il &quot;seguito alla stimolazione ad alta frequenza&quot; (il numero di risposte efficaci a un certo numero di stimoli ad alta frequenza) fornisce un modo per valutare in modo riproducibile e quantitativamente lo stato funzionale dei componenti GFS, includendo sia le sinapsi centrale (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) e la chimica (glutamatergica) giunzioni neuromuscolari (TTMn-TTM e DLMn-DLM). È stato usato per identificare i geni coinvolti nella formazione di sinapsi centrali e per valutare la funzione del SNC.

Il sistema di fibra Gigante è un semplice circuito neuronale di adulti<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Contenente la più grande neuroni al volo. Noi descriviamo il protocollo per il monitoraggio trasmissione sinaptica attraverso questo percorso attraverso la registrazione dei potenziali sinaptici posta in dorsale longitudinale (DLM) e tergotrochanteral (TTM) muscoli dopo stimolazione diretta del interneuroni fibra gigante.

Le registrazioni elettrofisiologiche dal Percorso di Fiber Gigante D. melanogaster</em

Quando vengono spaventati, gli adulti di D. melanogaster reagiscono saltando in aria e volando via. In molte specie di invertebrati, tra cui D. melanogaster, la "fuga"...

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare la trasmissione sinaptica attraverso il percorso della fibra gigante registrando i potenziali post-sinaptici da un muscolo dorsale longitudinale o DLM e da un muscolo trocantorale del Togo o TTM, a seguito della stimolazione diretta della fibra gigante nei neuroni. Questo viene ottenuto innanzitutto fissando correttamente una mosca anestetizzata in una capsula contenente una piccola quantità di cera. Il passaggio successivo della procedura consiste nell'inserire gli elettrodi di stimolazione, di massa e di registrazione nella mosca.L'ultimo passaggio della procedura consiste nello stimolare il cervello e registrare le risposte dai muscoli del salto e del volo. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano variazioni nelle proprietà funzionali del circuito delle fibre giganti in funzione del genotipo, dell'età, della temperatura, ecc. Registrando l'intervallo di tempo tra lo stimolo e la risposta, e contando il numero di risposte efficaci successive a una serie ad alta frequenza di stimoli.Questo metodo può contribuire a rispondere ad alcune delle domande fondamentali nel campo della neurofisiologia e permette di esaminare le proprietà funzionali dei percorsi neuronali. Questa tecnica può essere utilizzata sia come esperimento introduttivo seguito da analisi genetiche o molecolari, sia come metodo per valutare le proprietà fisiologiche e funzionali in animali portatori di una mutazione nota. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale.Considerato che i passaggi di preparazione e di induzione del danno richiedono un certo tempo per essere appresi, e poiché le mosche sono relativamente piccole, è necessario acquisire un certo livello di fermezza e coordinazione prima di poter eseguire correttamente gli esperimenti. Questi esperimenti utilizzano un impianto standard di elettrofisiologia composto da uno stimolatore, un'unità di isolamento dello stimolo, due amplificatori per microelettrodi, un sistema di acquisizione dati e un computer dotato di software per la raccolta dati.L'attrezzatura aggiuntiva comprende una gabbia di Faraday, un microscopio stereoscopico su un supporto a braccio, un tavolo di isolamento dalle vibrazioni, una sorgente luminosa e una piattaforma di registrazione. Vengono utilizzati cinque micromanipolatori. Due micromanipolatori richiedono controlli fini per posizionare gli elettrodi di registrazione, mentre gli altri tre micromanipolatori richiedono soltanto controlli grossolani.Per posizionare i due elettrodi di stimolazione e l'elettrodo di terra, il manipolatore per l'elettrodo di registrazione del DLM viene posizionato all'estremità caudale del preparato. Il micromanipolatore per l'elettrodo di registrazione del TTM viene posizionato tra l'operatore e il lato del preparato. I due micromanipolatori per gli elettrodi di stimolazione vengono posizionati all'estremità cefalica del preparato.Il micromanipolatore per l'elettrodo di terra è posizionato sul lato opposto della preparazione. Tirare microelettrodi di vetro per la registrazione con resistenze comprese tra 40 e 60 megaohm e conservarli in piano in una capsula sostenuta da cera. Utilizzare due elettrodi al tungsteno affilati elettromagneticamente per la stimolazione.Utilizzare un filo di collegamento o un terzo elettrodo fabbricato elettromagneticamente. Come riferimento, collegare gli elettrodi di stimolazione e di riferimento ai micromanipolatori prima dell'inizio della sessione sperimentale. Non sarà necessario sostituirli per tutta la durata della sessione.Dopo aver configurato l'attrezzatura, è il momento di preparare le mosche. Anestetizzare le mosche raffreddandole sul ghiaccio per 10-15 minuti. Utilizzare pinzette per trasferire delicatamente la mosca per le zampe in una capsula contenente una piattaforma di cera morbida inclinata di circa 45 gradi.Il passo successivo consiste nel fissare la mosca alla cera. Orientare la mosca con il lato ventrale rivolto verso il basso e l'estremit&agrave; anteriore rivolta verso l'alto lungo la pendenza. Utilizzando un paio di pinzette fini, estendere le zampe verso l'esterno a coppie e inserirle nella cera.Una volta presa familiarità con la posizione dei muscoli da registrare prima di iniziare questo esperimento, il muscolo dorsale longitudinale (DLM) e il muscolo turga TRO cantorale (TTM), i siti di attacco sottocuticolari dei DLM corrispondono alla regione compresa tra la linea mediana toracica e le setole dorsali anteriori. I siti di attacco del TTM si trovano in posizione dorsale rispetto alle setole sopraalarie anteriori e posteriori; per assicurarsi che le ali non ostacolino l'accesso alle fibre del DLM o del TTM, tenere le ali allontanate e incollarle alla cera. Utilizzando un paio di pinzette fini, tirare con attenzione il pteropleuro all'esterno e fissarlo immergendolo nella cera.Questo è un passaggio critico che richiede un po' di pratica, poiché il probo sceglie è morbido e si stacca facilmente dal resto della testa. In tal caso, scartare il moscerino e ricominciare. Il mancato fissaggio della testa in questo modo provoca problemi durante l'inserimento degli elettrodi stimolanti attraverso gli occhi.Una volta fissata la mosca alla cera, posizionare il preparato sotto il microscopio stereoscopico all'interno della gabbia di Faraday, orientando la mosca di lato con la testa rivolta verso destra rispetto all'operatore. Il passo successivo consiste nell'inserire gli elettrodi. Avvicinare gli elettrodi ai punti di inserzione avvalendosi dei micromanipolatori, in modo da facilitarne il posizionamento corretto e le successive registrazioni; senza guardare attraverso il microscopio, abbassare l'elettrodo di terra nell'estremit&agrave; posteriore dell'addome utilizzando le manopole di regolazione del micromanipolatore, quindi posizionare gli elettrodi stimolanti in tungsteno affilati nel cervello.Utilizzare il micromanipolatore per posizionare la punta di uno dei due elettrodi in modo che tocchi appena uno degli occhi della mosca. Ripetere l'operazione con l'altro elettrodo, in modo che entrambi gli elettrodi tocchino leggermente l'esterno di ciascun occhio. Quindi spingere gli elettrodi all'interno.Ruotare ciascun elettrodo di circa due-tre millimetri in modo che le punte degli elettrodi raggiungano il cervello situato nella parte posteriore della capsula cefalica. Gli elettrodi posizionati correttamente attiveranno il sistema delle fibre giganti per verificare che gli elettrodi stimolanti siano stati posizionati correttamente. Applicare un breve stimolo di 30-60 volt tra gli elettrodi stimolanti e osservare movimenti delle ali e contrazioni dei muscoli del volo o delle zampe.Il passo successivo consiste nel riempire retrospettivamente i microelettrodi di vetro con cloruro di potassio tre molare, utilizzando una siringa di plastica Hamilton o tirata a caldo, e nel posizionarli nei micromanipolatori a controllo fine. I microelettrodi inseriti correttamente possono essere utilizzati per diverse serie di esperimenti. Il primo elettrodo di registrazione verrà inserito in una fibra DLM.Esistono due DLM simmetrici bilateralmente. Ognuno è composto da sei fibre muscolari individuali. Le registrazioni possono essere effettuate da una qualsiasi delle sei fibre; tuttavia, le fibre DLM 45 A e 45 B sono quelle più comunemente utilizzate, grazie alla loro buona accessibilità attraverso il lato dorsale della cuticola toracica e al fatto che entrambe le fibre sono innervate dallo stesso neurone motore.Utilizzando il micromanipolatore posizionato sulla coda dell'inseritore, inserire l'elettrodo di registrazione nella fibra DLM 45 A o B sul lato della mosca più distante. L'inclinazione della piattaforma permette all'elettrodo DLM di entrare nella cuticola dorsale con un angolo compreso tra 60 e 90 gradi, facilitando la penetrazione mediante l'uso del software in modalità oscilloscopio. Osservare il monitor del computer durante l'inserimento dell'elettrodo di registrazione nel torace.Quando l'elettrodo è entrato in un muscolo, la linea di base scende a un valore prossimo allo zero o negativo; eseguire un test con uno stimolo singolo per verificare se è possibile osservare la risposta muscolare. Inserire l'altro elettrodo di registrazione nel muscolo TTM sul lato della mosca più vicino a voi. Questo elettrodo viene inserito lateralmente davanti a voi a causa della posizione del sito di attacco muscolare.Osservare nuovamente il monitor durante questa operazione. Una volta che il tracciato indica che l'elettrodo è all'interno del muscolo, effettuare un test con uno stimolo singolo per ottenere una risposta muscolare. Per iniziare a stimolare il cervello e registrare le risposte dai muscoli della zampa e dei muscoli del volo, applicare uno stimolo di 0,03 millisecondi attraverso gli elettrodi di stimolazione, partendo da 30 volt e aumentando fino a 60 volt, finché non si osserva una contrazione muscolare e una depolarizzazione della cellula muscolare sul monitor del computer.Per il resto dell'esperimento, impostare la tensione da cinque a dieci volt al di sopra della soglia di risposta. Per misurare la latenza della risposta, somministrare almeno cinque stimoli singoli con un periodo di riposo di cinque secondi tra ogni stimolo.Determinare la frequenza di risposta fornendo serie di stimoli a diverse velocità. Tipicamente, vengono somministrate 10 serie di 10 stimoli a 100 hertz, 200 hertz e 300 hertz, con un periodo di riposo di due secondi tra ogni serie di stimoli. Questa figura mostra le risposte registrate dai TTM e dai dlm in seguito a uno stimolo singolo applicato al cervello.La latenza della risposta è il tempo tra la stimolazione del cervello e la depolarizzazione del muscolo. Una preparazione sana e una corretta tecnica di registrazione sono indicate da latenze comprese tra 0,7 e 1,2 millisecondi per il percorso G-F-T-T-M e tra 1,2 e 1,7 millisecondi per il percorso GF DLM. Le latenze possono variare in base al genotipo, all'ambiente genetico, alla temperatura e all'età, come mostrato qui.Le registrazioni ottenute dal TTM mostrano una maggiore variabilità in termini di ampiezza e forma del potenziale post-sinaptico rispetto a quelle provenienti dalle grandi fibre DLM. Questa variabilità aumentata è dovuta alle piccole dimensioni delle fibre muscolari del TTM. Tuttavia, tale variabilità non influenza i valori di latenza della risposta nel percorso del fibra gigante verso il TTM.Questa figura mostra la stimolazione di TTM e DLM a 100 hertz e 200 hertz a 100 hertz. Sia i TTM che i DLM rispondono a tutti e 10 gli stimoli a 200 hertz. Le risposte di TTM rimangono uno-a-uno, tuttavia le risposte di DLM iniziano a mancare.Il motivo per cui il DLM non riesce a seguire frequenze di stimolazione superiori a 100 hertz è che la sinapsi chimica intermedia tra due interneuroni non ha tempo sufficiente per ripristinarsi tra uno stimolo e l'altro. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 30 minuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come monitorare la trasmissione neurochimica attraverso il percorso della fibra gigante.Questo viene fatto stimolando la fibra gigante verso i neuroni nel cervello, per poi effettuare la registrazione da un muscolo del salto e dai muscoli del volo nel torace.

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JoVE Journal

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Neuroscienze

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Metodi elettrofisiologici per la registrazione Potenziali Synaptic dal NMJ Larve di Drosophila

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Monte Preparazione tutto il Adulti Drosophila Cordone nervoso ventrale per iniezione Giant Dye Fibra

Nanoinjection associato e test Elettrofisiologia allo schermo per la bioattività dei composti con il Drosophila melanogaster Sistema Fiber Giant

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