JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
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Inizia con cellule di ameba di Dictyostelium discoideum wild-type sospese in un tampone freddo.
Il tampone fornisce un ambiente ionico che mantiene la stabilità della membrana.
Quindi, aggiungi le cellule dell'ameba a una provetta contenente un plasmide con il gene bersaglio.
Mescolare delicatamente la soluzione per portare i plasmidi a stretto contatto con la superficie dell'ameba.
Trasferire questa miscela in una cuvetta di elettroporazione pre-raffreddata ed eseguire l'elettroporazione.
Durante l'elettroporazione, gli impulsi elettrici creano pori transitori nella membrana cellulare.
Il plasmide entra attraverso questi pori nel citoplasma e successivamente trasloca nel nucleo.
Successivamente, trasferire le cellule dell'ameba in una capsula di Petri contenente un mezzo liquido integrato con batteri alimentatori.
L'ameba consuma i batteri attraverso la fagocitosi, fornendo nutrienti essenziali per il recupero cellulare e consentendo l'espressione plasmidica.
I batteri alimentatori supportano la trasfezione nelle cellule di ameba wild-type, senza la necessità di ceppi speciali che crescono senza batteri.
Risospendere le celle nel tampone H40.
Quindi, aggiungi 100 microlitri di cellule in una
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