Arricchimento di lipoproteine batteriche mediante separazione di fase con detergente non ionico

Prendi un lisato batterico contenente proteine idrofile, lipoproteine e aggregati proteici.

Aggiungere un detergente freddo, non ionico, in grado di separare le fasi a temperature più calde.

Incubare su ghiaccio e mescolare periodicamente. Il detergente si lega alla porzione lipidica della lipoproteina, formando complessi proteina-detergente.

Scaldare la miscela per indurre la separazione di fase. Le lipoproteine si concentrano nella fase detergente, mentre le proteine idrofile rimangono nella fase acquosa.

Centrifugare a temperatura ambiente per mantenere la separazione bifasica.

Scartare la fase acquosa, aggiungere un tampone freddo alla fase detergente e mescolare.

Ripetere il ciclo di raffreddamento, riscaldamento e centrifugazione per arricchire le lipoproteine.

Quindi, aggiungere un tampone freddo e centrifugare a bassa temperatura per pellettare gli aggregati non lipoproteici.

Trasferire il surnatante in una provetta contenente un solvente che precipita le proteine e incubare a temperatura inferiore allo zero per far precipitare le lipoproteine.

Centrifugare a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.

Le lipoproteine precipitate sono pronte per gli studi a valle.

Integrare il surnatante con tensioattivo TX-114 a una concentrazione finale del 2% aggiungendo un volume uguale di tensioattivo al 4% in TBSE ghiacciato. Incubare il surnatante integrato su ghiaccio per un'ora, mescolando per inversione ogni 15 minuti. Trasferire la provetta in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e incubare per 10 minuti per indurre la separazione di fase.

Centrifugare il campione a 10.000 volte g per 10 minuti a temperatura ambiente per mantenere la separazione bifasica. Pipettare delicatamente la fase acquosa superiore e gettarla. Aggiungere il TBSE ghiacciato alla fase inferiore del tensioattivo per riempire il tubo al suo volume originale e capovolgerlo per mescolare.

Incubare su ghiaccio per 10 minuti. Dopo l'incubazione, trasferire la provetta in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e incubare per 10 minuti per indurre la separazione di fase, quindi centrifugare a 10.000 volte g per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver ripetuto ancora una volta questi passaggi per un totale di tre separazioni, rimuovere la fase acquosa superiore e scartare.

Rimuovere il pellet di proteine precipitate che si è formato durante il corso delle estrazioni aggiungendo un volume di TBSE ghiacciato alla fase tensioattiva. Centrifugare a quattro gradi Celsius e 16.000 volte g per due minuti per pellettare la proteina insolubile. Trasferire immediatamente il surnatante in una provetta da microcentrifuga fresca da 2,0 millilitri contenente 1.250 microlitri di acetone al 100%.

Mescolare il campione per inversione e incubare per una notte a meno 20 gradi Celsius per far precipitare la proteina. Il giorno successivo, centrifugare il campione a 16.000 volte g per 20 minuti a temperatura ambiente per pellettare le lipoproteine prestando attenzione all'orientamento della provetta. Lavare il pellet due volte con acetone al 100% prima di travasare l'acetone e lasciare asciugare il campione all'aria.

Quindi, aggiungere da 20 a 40 microlitri di Tris-HCL da 10 millimolari, pH 8,0, e risospendere accuratamente il pellet pipettandolo su e giù contro la parete con le lipoproteine precipitate.