JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:28 min. • October 30th, 2025
Iniziare con una soluzione di resina a scambio ionico contenente gruppi funzionali caricati positivamente per il legame selettivo delle proteine.
Successivamente, prendi un estratto proteico ottenuto da cellule batteriche ospiti ingegnerizzate per sovraesprimere un fattore di virulenza dal batterio patogeno Helicobacter pylori.
L'estratto contiene il fattore di virulenza target insieme alle proteine della cellula ospite in un tampone a pH 8.
Mescolare l'estratto proteico con la resina e incubare agitando per garantire un'interazione uniforme proteina-resina.
Le proteine ospiti, avendo punti isoelettrici inferiori al pH del tampone, si caricano negativamente e si legano alla resina caricata positivamente.
La proteina bersaglio, con un punto isoelettrico vicino al pH del tampone, rimane in gran parte priva di carica e rimane non legata.
Trasferire l'impasto proteico-resinoso in una colonna cromatografica e lasciare che la resina si depositi.
Raccogliere la fase liquida contenente la proteina bersaglio non legata.
Sciacquare la resina con il tampone per garantire il massimo recupero della proteina bersaglio.
Per preparare 15 millilitri di resina DEAE, sospendere 0,6 grammi di polvere secca di resina DEAE in 30 millilitri di tampone Tris-HCl a temperatura ambiente per almeno un giorno.
Centrifugare la resina a 10.000 volte g a quattro gradi Celsius per un minuto, quindi rimuovere e scartare il surnatante. Quindi, aggiungere 15 millilitri di tampone Tris-HCl. Dopo aver ripetuto la centrifugazione, le fasi di risospensione altre quattro volte, conservare i 15 millilitri di resina stabilizzata a quattro gradi Celsius per un uso successivo.
Lavorando a quattro gradi Celsius, aggiungere 45 millilitri di proteine solubili preparate a 15 millilitri di resina e trasferire in un becher da 100 millilitri con ancoretta di combustione. Mescolare l'impasto di resina proteica utilizzando una piastra di agitazione a quattro gradi Celsius per un'ora. Quindi, versare l'impasto di resina proteica in una colonna di plastica o di vetro dotata di rubinetto e lasciare che la resina si depositi per gravità.
Aprire il rubinetto per consentire alla soluzione proteica di scorrere attraverso la colonna per gravità fino a quando il livello del liquido nella colonna non è appena sopra la resina. Raccogli il flusso attraverso la frazione non legata che contiene la proteina attivante i neutrofili purificata. Aggiungere 15 millilitri di tampone Tris-HCl ghiacciato nella colonna.
Aprire nuovamente il rubinetto per consentire al tampone di lavaggio di scorrere attraverso la colonna per gravità fino a quando il livello del liquido nella colonna non è appena sopra la resina. Raccogliere il flusso attraverso come frazione di lavaggio. Ripetere il lavaggio con un tampone ghiacciato altre quattro volte per raccogliere le frazioni di lavaggio aggiuntive.