Una procedura per la purificazione di una proteina marcata con poliistidina da Streptococcus mutans

Prendiamo una coltura di Streptococcus mutans che esprime una proteina marcata con poliistidina secreta nel terreno.

Centrifugare la coltura e raccogliere il surnatante ricco di proteine.

Aggiungere solfato di ammonio e incubare agitando per precipitare le proteine riducendone la solubilità.

Trasferire la soluzione in una provetta, centrifugare ed eliminare il surnatante.

Risospendere il pellet in un tampone legante contenente sali e basso imidazolo per stabilizzare la proteina.

Dializzare la soluzione con il tampone legante fresco per rimuovere i sali in eccesso.

Centrifugare la soluzione dializzata in pellet di detriti insolubili, quindi filtrare il surnatante.

Miscelare il filtrato con resina di affinità caricata con nichel e incubare per consentire il legame selettivo della proteina marcata con poliistidina agli ioni nichel.

Caricare la miscela sulla colonna cromatografica e lavare con il tampone legante per rimuovere le proteine non legate.

Successivamente, aggiungere un tampone di eluizione con imidazolo alto per sostituire l'istidina dagli ioni nichel e rilasciare la proteina marcata con poliistidina.

Raccogli questo eluato contenente le proteine purificate.

Centrifugare la sospensione