JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:00 min. • October 30th, 2025
Prendi una sospensione omogenea di caseo, il materiale necrotico ricco di lipidi delle lesioni della tubercolosi, che ospita micobatteri tolleranti ai farmaci al suo interno.
Aggiungere il farmaco in esame all'omogenato e al vortice per facilitarne l'interazione con la matrice del caseo.
Posizionare un inserto per dialisi a rapido equilibrio, contenente camere donatrici e riceventi separate da una membrana semipermeabile, nella piastra di base.
Caricare l'omogeneizzato addizionato di farmaco nella camera donatrice e aggiungere il tampone alla camera ricevente.
Sigillare la piastra e incubare con la rotazione.
Durante l'incubazione, il farmaco libero si diffonde attraverso la membrana, raggiungendo l'equilibrio tra le due camere.
Una volta raggiunto l'equilibrio, diluire il campione donatore con tampone e il campione ricevente con omogenato libero da farmaci per normalizzare le condizioni della matrice per la quantificazione del farmaco.
Infine, quantificare la concentrazione del farmaco e calcolare la frazione del farmaco non legato o fu.
Il fu riflette il farmaco libero disponibile per diffondersi nel caseo e raggiungere micobatteri tolleranti ai farmaci.
Aggiungere 6,5 microlitri del composto di prova preparato a 643,5 microlitri di omogeneizzato. Per ottenere la concentrazione finale di cinque micromolari e vortici.
Quindi, posizionare gli inserti rossi nella piastra di base. Preparare gli inserti per ogni test, ogni composto in triplice copia.
Aggiungere 200 microlitri di matrice addizionata con il farmaco nella camera donatrice rossa di ciascun inserto rosso. Quindi, aggiungere 350 microlitri di PBS in ciascuna camera del ricevitore.
Posizionare un sigillo adesivo sulla piastra e incubarla a 37 gradi Celsius sul miscelatore termico a 200 rotazioni al minuto per quattro ore. Dopo l'incubazione, mescolare delicatamente il contenuto delle camere donatrice e ricevente pipettando su e giù due o tre volte. Trasferire 20 microlitri di omogeneizzato da ciascuna delle camere donatrici a 20 microlitri di PBS pulito in una provetta da 1,5 millilitri.
Allo stesso modo, trasferire 20 aliquote di microlitri di campioni di PBS dalle camere del ricevitore a 20 microlitri di omogeneizzato pulito.
La corrispondenza della matrice elimina la necessità di realizzare due curve di visione dei colori separate nell'omogeneizzato e nel PBS per l'analisi quantitativa. Il contenuto della camera donatrice può sedimentare nel tempo. Miscelare delicatamente il contenuto pipettando prima di rimuovere le aliquote.