JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:09 min • October 30th, 2025
Iniziare con una coltura batterica ed eseguire una diluizione seriale per ridurre la densità cellulare.
Prelevare una piccola aliquota della diluizione finale e posizionarla su una piastra di agar.
Aggiungere perle di vetro sterili e agitare delicatamente la piastra per garantire la separazione spaziale delle cellule, essenziale per ottenere colonie ben isolate.
Rimuovere le perle di vetro, quindi capovolgere la piastra e incubare.
Le singole cellule proliferano e formano colonie separate, generando una coltura monoclonale in cui ogni colonia è costituita da una popolazione batterica geneticamente uniforme.
Prelevare le singole colonie e trasferirle in provette separate contenenti un mezzo liquido.
Incubare le provette con agitazione. Dopo l'incubazione, valutare la torbidità di ciascuna coltura.
Le cellule batteriche sospese nel mezzo diffondono la luce, facendo apparire le colture più torbide con l'aumentare della densità cellulare.
Selezionare la provetta con la torbidità più elevata, che indica la popolazione batterica monoclonale più densa, per le applicazioni a valle.
Etichettare le tre bottiglie preparate con 100 millilitri di brodo LB Lennox con il numero uno, il numero due e il numero tre.
Pipettare 0,1 millilitri della coltura batterica risultante nel flacone uno. Tappare la bottiglia e farla oscillare a mano per un minuto per ottenere una soluzione omogenea. Quindi, pipettare 0,1 millilitri dal flacone numero uno al flacone numero due. Ancora una volta, tappate la bottiglia e fatela oscillare a mano per un minuto. Eseguire l'ultima diluizione pipettando 0,1 millilitri dal flacone numero due al flacone numero tre. Tappare la bottiglia e agitarla a mano per un minuto.
E poi pipettare 20 microlitri di soluzione su ciascuna delle quattro piastre di Petri. Quindi, posizionare quattro perle di vetro autoclavate di tre millimetri di diametro in ciascuna delle piastre di Petri. Chiudere i coperchi delle piastre di Petri e agitarle a mano per un minuto.
Al termine, capovolgere le piastre di Petri e incubare le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 24 ore.
Con una spatola di acciaio inossidabile, prelevare i batteri monoclonali risultanti dalle quattro piastre di Petri e inserirli nelle restanti sette provette contenenti 12,5 millilitri di brodo LB Lennox. Lasciare i tubi nell'incubatore a 37 gradi Celsius per 24 ore, quindi scegliere quello con la maggiore diffusione della luce utilizzando il metodo colorimetrico visivo.