JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:48 min. • October 30th, 2025
La fibrosi cistica (FC) è una malattia genetica che causa l'accumulo di muco denso e appiccicoso nei polmoni, formando l'espettorato che supporta la crescita microbica patogena.
Per preparare l'espettorato fibrosi cistica artificiale, assumere soluzioni con proprietà biochimiche chiave.
La miscela di mucina contiene mucine, che sono glicoproteine ad alto peso molecolare, per replicare la viscosità dell'espettorato CF e promuovere l'adesione microbica.
La miscela chimica fornisce ioni e glucosio per supportare il metabolismo microbico.
La miscela biologica fornisce nutrienti per la crescita microbica.
Combina il tutto per formare il mezzo di espettorato artificiale (ASM).
Aggiungere un agente tampone per mantenere un pH leggermente acido che favorisce la sopravvivenza degli agenti patogeni.
Per la sterilizzazione media, trasferire l'ASM in una camera di filtrazione sottovuoto con un filtro a membrana.
Filtrare sotto agitazione per evitare l'aggregazione della mucina e prevenire l'intasamento del filtro.
Il vuoto aspira il mezzo attraverso il filtro, rimuovendo i contaminanti microbici e gli aggregati macromolecolari.
L'ASM è pronto per la coltura di microbi associati alla fibrosi cistica.
Preparare un terreno di coltura per l'espettorato artificiale aggiungendo 250 millilitri di ASCM al flacone da 1 litro contenente ASMM. Quindi, aggiungere 250 millilitri di ASBM al flacone medio. Titolare il terreno con un tampone MOPS basico da 1 molare per raggiungere un pH di 6,3 su carta a pH naturale.
Refrigerare il mezzo di espettorato artificiale a 4 gradi Celsius fino alla filtrazione. Quindi, per avviare il processo di filtrazione, trasferire 200 millilitri di terreno di espettorato artificiale non filtrato in un sistema di filtrazione sottovuoto con un filtro di dimensioni dei pori di 0,22 micrometri. Dopo aver collegato il sistema di filtrazione alla pompa del vuoto, accendere la pompa del vuoto. Quindi, posizionare la camera su un agitatore orbitale, agitando a 90 rotazioni al minuto in una cella frigorifera a 4 gradi Celsius.
Sostituire il filtro dopo che 350 millilitri di terreno sono stati filtrati per superare il problema dell'intasamento. Dopo aver filtrato una quantità considerevole, aggiungere altri 150 millilitri di terreno per la filtrazione. Ripetere la filtrazione con camere aggiuntive fino a quando tutto il mezzo non è filtrato.