Quantificazione delle unità formanti colonie di batteri associati all'intestino nelle mosche Drosophila

Iniziare con una micropiastra contenente omogeneizzati preparati con mosche Drosophila . Queste mosche ospitavano una popolazione controllata di un batterio specifico nel loro intestino.

Gli omogeneizzati contengono tessuti di mosca lisati e batteri intestinali rilasciati.

Aspirare i batteri sospesi e diluirli in serie su più micropiastre.

Individuare piccoli volumi da ogni diluizione su piastre di agar, assicurandosi che le goccioline rimangano separate.

Incubare per consentire ai batteri di proliferare in colonie visibili.

Acquisisci immagini delle piastre per quantificare le unità formanti colonie (CFU), che rappresentano il numero di cellule batteriche vitali in grado di formare singole colonie.

Utilizzando un software di analisi delle immagini, allinea ogni immagine utilizzando una linea di riferimento, definisci un confine e applica una griglia uniforme per segmentarla in zone di conteggio, ciascuna corrispondente a un singolo punto.

Regola la soglia di luminosità per distinguere le singole colonie dallo sfondo, quindi esegui l'analisi per contare le colonie in ogni punto e quantificare i CFU.

Posizionare tre piastre rettangolari per la crescita dell'agar MRS con i coperchi aperti nella cappa di biosicurezza ad asciugare per almeno 10 minuti. Preparare due piastre di diluizione aggiungendo 100 microlitri di PBS a ciascun pozzetto di una piastra sterile a 96 pozzetti utilizzando un pipettatore a 96 canali. Caricare un rack di puntali P-20 sul pipettatore a 96 canali.

Effettuare una diluizione 1:10 aspirando 11,1 microlitri di omogeneizzato dalla piastra del campione. Ora, erogarlo nella prima piastra di diluizione contenente 100 microlitri di PBS sterile per pozzetto. Tenere la piastra di diluizione sullo shaker per piastre per 10 secondi a 600 giri/min.

Miscelare nuovamente pipettando su e giù almeno 10 volte. Trasferire 11,1 microlitri dalla prima piastra di diluizione alla seconda piastra di diluizione e ripetere le fasi di miscelazione per eventuali ulteriori diluizioni. Per le piastre di spotting, caricare due microlitri da ciascun pozzetto nel pipettatore a 96 canali.

Abbassare lentamente la testina del pipettatore sulla piastra, evitando di infilzare nell'agar, e assicurarsi che tutti i punti siano stati erogati. Quindi, controlla che le macchie di liquido si impregnino rapidamente nell'agar e non cocleano insieme. Ripetere il processo di placcatura per le restanti piastre di diluizione come descritto nel manoscritto.

Una volta che il liquido è stato completamente assorbito nell'agar, capovolgere le piastre e incubarle fino a quando le colonie non hanno raggiunto la dimensione ottimale. Organizza le lastre in modo logico e mantienile in un ordine specifico durante la fotografia. Orientali in modo che A1 si trovi nell'angolo in alto a sinistra per tutte le piastre.

Dopo aver rimosso il coperchio della piastra, posizionare la piastra sul tavolino con A1 orientato nell'angolo corretto. Immaginate le lastre. Trasferisci le immagini su un computer e rinominale, includendo il nome dell'esperimento, il tipo di supporto, il fattore di diluizione e altri dettagli pertinenti.

Organizzare le immagini da elaborare per la quantificazione in una cartella. I nomi dei file che distinguono le piastre diventano titoli di colonna per ogni serie di conteggi nel foglio di calcolo di output. Crea sottocartelle denominate Ritagliate e Ricevute nella cartella.

Queste cartelle riceveranno i file di output. Ora avvia il plug-in Croptacular da ImageJ e fai clic su OK per iniziare il ritaglio. Verrà visualizzata una finestra di dialogo per scegliere la cartella di origine.

Selezionare la cartella di origine e fare clic su Apri. Quindi, fare clic su OK nella finestra di dialogo per scegliere la directory di destinazione. Selezionare la cartella di destinazione e premere Apri.

Se l'immagine è già dritta, premi semplicemente la barra spaziatrice. In caso contrario, raddrizza l'immagine tracciando una linea lungo un bordo che dovrebbe diventare orizzontale. Ridisegna la linea tutte le volte che è necessario se l'immagine non appare diritta.

Quindi, disegna un riquadro di delimitazione per l'area di conteggio e regolane le dimensioni e le proporzioni fino a quando tutti i punti sono all'interno delle loro celle. Trascinare il cursore all'esterno del riquadro di delimitazione per aggiornare la griglia. Quando la griglia ha un bell'aspetto, premi la barra spaziatrice.

Poiché il plug-in presume che tutte le foto siano allineate in modo identico, assicurati che l'immagine successiva ruoti automaticamente allo stesso angolo della prima. Se questo è corretto, premi la barra spaziatrice per continuare. In caso contrario, raddrizzare l'immagine come prima.

La griglia richiama anche la stessa posizione dell'immagine precedente. Regolare se necessario e premere la barra spaziatrice. Avvia Count-On-It e seleziona Gridiron.

Impostate l'intensità della colonia di soglia in base a un valore superiore e inferiore di intensità dei pixel. Rendi la soglia il più rigorosa possibile, pur selezionando tutte le colonie. Fare clic su OK nella finestra di dialogo Azione richiesta quando la soglia è soddisfacente, quindi fare clic su OK per continuare.

Nella prima immagine, viene data l'opzione per procedere o tornare al menu di configurazione. Per procedere con l'elaborazione batch, fare clic su OK. Quindi, seleziona una cartella per conservare la tabella delle ricevute e dei risultati. Utilizzare la cartella Ricevute creata in precedenza.

Dopo la prima immagine, per impostazione predefinita, le immagini successive avranno la stessa soglia delle impostazioni precedenti. Fare clic su OK per utilizzare queste impostazioni o regolare le impostazioni.