Rilevamento dei trasportatori metallici di superficie in Neisseria gonorrhoeae mediante Dot Blot
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:08 min. • November 5th, 2025
Inizia con una coltura di Neisseria gonorrhoeae coltivata in un terreno impoverito di metalli.
La scarsità di metalli innesca l'espressione di trasportatori della membrana esterna che avviano l'assorbimento del metallo quando disponibili.
Posizionare una membrana di nitrocellulosa preimbevuta su carta da filtro umida e assemblare l'apparato per il dot blot.
Individua le cellule batteriche e lascia che il liquido venga assorbito.
Smontare l'apparecchio, rimuovere la membrana e asciugarla all'aria.
Aggiungere un agente bloccante per impedire l'associazione non specifica.
Reinserire la membrana nell'apparecchio, sigillarla con parafilm e rimontarla.
Aggiungere un ligando legante il metallo derivato dall'ospite e incubare agitando.
Il ligando si lega ai trasportatori batterici.
Rimuovere il liquido e lavare la membrana per rimuovere l'eventuale legante non legato.
Aggiungere un anticorpo primario ligando-specifico, seguito da un anticorpo secondario coniugato con un enzima e un reagente di rilevamento colorimetrico che forma un prodotto colorato.
Un segnale visibile indica l'espressione di trasportatori metallici batterici in condizioni di metallo limitato.
Dopo il raddoppio di massa, diluire nuov
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