JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
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Inizia con una coltura di Neisseria gonorrhoeae coltivata in un terreno impoverito di metalli.
La scarsità di metalli innesca l'espressione di trasportatori della membrana esterna che avviano l'assorbimento del metallo quando disponibili.
Posizionare una membrana di nitrocellulosa preimbevuta su carta da filtro umida e assemblare l'apparato per il dot blot.
Individua le cellule batteriche e lascia che il liquido venga assorbito.
Smontare l'apparecchio, rimuovere la membrana e asciugarla all'aria.
Aggiungere un agente bloccante per impedire l'associazione non specifica.
Reinserire la membrana nell'apparecchio, sigillarla con parafilm e rimontarla.
Aggiungere un ligando legante il metallo derivato dall'ospite e incubare agitando.
Il ligando si lega ai trasportatori batterici.
Rimuovere il liquido e lavare la membrana per rimuovere l'eventuale legante non legato.
Aggiungere un anticorpo primario ligando-specifico, seguito da un anticorpo secondario coniugato con un enzima e un reagente di rilevamento colorimetrico che forma un prodotto colorato.
Un segnale visibile indica l'espressione di trasportatori metallici batterici in condizioni di metallo limitato.
Dopo il raddoppio di massa, diluire nuovamente le colture con tre volumi di CDM. Quindi, incubare le colture a 37 gradi Celsius agitando per quattro ore. Poco prima delle quattro ore, tagliare tre pezzi di carta da filtro e un pezzo di nitrocellulosa alla dimensione approssimativa necessaria per entrare in un apparecchio a punti.
Immergere la nitrocellulosa in acqua deionizzata per circa 10 minuti prima di assemblare l'apparecchio con carta da filtro sotto la nitrocellulosa. Al termine dell'incubazione, registrare le densità cellulari e standardizzare le densità a una densità finale appropriata. Quindi, pipettare le colture cellulari sulla nitrocellulosa.
Quando la carta da filtro ha assorbito tutto il liquido, smontare l'apparecchio e lasciare asciugare la macchia. Bloccare la membrana di nitrocellulosa per un'ora con una soluzione bloccante appropriata e rimontare l'apparato dot-blot, sostituendo la carta da filtro con un film di paraffina per creare una tenuta stagna sotto la nitrocellulosa. Diluire il ligando legante il metallo di interesse a 0,2 micromolari in bloccante e sondare le cellule per un'ora con agitazione moderata.
Al termine dell'incubazione, aspirare il liquido con un aspirapolvere, lavare il blot e seguire le procedure immunologiche standard per sviluppare il segnale.