Misurazione dei tassi di traduzione errata di Mycobacterium smegmatis utilizzando un sistema reporter GFP/luciferasi

Prendiamo una coltura di Mycobacterium smegmatis che ospita geni inducibili per la GFP e una luciferasi mutante marcata con segnale di secrezione.

Il gene mutante codifica per una luciferasi inattiva, ma l'errata traduzione naturale durante la sintesi proteica produce un enzima attivo.

La GFP funge da controllo interno per normalizzare l'espressione della luciferasi.

Aggiungere l'induttore per avviare l'espressione genica, quindi aliquotare la coltura in una piastra a più pozzetti.

Introdurre concentrazioni crescenti di una molecola di prova in pozzetti selezionati. Incubare.

In condizioni di controllo, l'errore di traduzione provoca la secrezione attiva di luciferasi.

Se la molecola in esame inibisce l'errata traduzione, la secrezione attiva di luciferasi diminuisce.

Trasferire le aliquote di coltura su una piastra nera e misurare la fluorescenza GFP.

Centrifuga per pellettare le cellule.

Trasferire i surnatanti contenenti luciferasi secreta e aggiungere il substrato, dove la luciferasi attiva catalizza la sua ossidazione, producendo luminescenza.

Misurare la luminescenza e calcolare il rapporto luciferasi/GFP; Un rapporto più basso indica una riduzione dell'errore di traduzione dovuto alla