JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:38 min. • October 30th, 2025
Prendiamo una coltura di Mycobacterium smegmatis che ospita geni inducibili per la GFP e una luciferasi mutante marcata con segnale di secrezione.
Il gene mutante codifica per una luciferasi inattiva, ma l'errata traduzione naturale durante la sintesi proteica produce un enzima attivo.
La GFP funge da controllo interno per normalizzare l'espressione della luciferasi.
Aggiungere l'induttore per avviare l'espressione genica, quindi aliquotare la coltura in una piastra a più pozzetti.
Introdurre concentrazioni crescenti di una molecola di prova in pozzetti selezionati. Incubare.
In condizioni di controllo, l'errore di traduzione provoca la secrezione attiva di luciferasi.
Se la molecola in esame inibisce l'errata traduzione, la secrezione attiva di luciferasi diminuisce.
Trasferire le aliquote di coltura su una piastra nera e misurare la fluorescenza GFP.
Centrifuga per pellettare le cellule.
Trasferire i surnatanti contenenti luciferasi secreta e aggiungere il substrato, dove la luciferasi attiva catalizza la sua ossidazione, producendo luminescenza.
Misurare la luminescenza e calcolare il rapporto luciferasi/GFP; Un rapporto più basso indica una riduzione dell'errore di traduzione dovuto alla molecola in esame.
Per iniziare, inoculare due millilitri di terreno 7H9 con il ceppo reporter batterico.
Agitare a 37 gradi Celsius per uno o due giorni o fino a quando il diametro esterno a 600 nanometri raggiunge la fase stazionaria.
Quindi, la subcoltura in 50 millilitri di terreno 7H9 e crescere fino a quando l'OD a 600 nanometri raggiunge la fase stazionaria tardiva. Prima di aliquotare i batteri in una piastra a 96 pozzetti, aggiungere ATC a una concentrazione finale di 50 nanogrammi per millilitro e mescolare bene.
Aggiungere 100 microlitri per pozzetto a una piastra trasparente a fondo tondo a 96 pozzetti. Successivamente, aggiungere diverse dosi di Ksg a pozzetti selezionati per esaminarne gli effetti sui tassi di traduzione errata. Aggiungere 200 microlitri di acqua sterile ai bordi della piastra per limitare l'evaporazione dai pozzetti del campione.
Sigillare la piastra, agitare e indurre i campioni a 37 gradi Celsius per 16-20 ore. Utilizzare una pipetta multicanale per prelevare 80 microlitri da ciascun pozzetto. Trasferire i campioni su una piastra a 96 pozzetti a fondo nero e misurare il segnale GFP con il luminometro.
Dopo aver misurato il segnale GFP, centrifugare la piastra a 3.220 volte g per 10 minuti. Quindi, trasferire 50 microlitri di surnatante in una piastra a 96 pozzetti a fondo bianco.
Quindi, aggiungere 50 microlitri di substrato Nluc a ciascun pozzetto, mescolare bene e misurare la luminescenza con il luminometro. Infine, determinare il rapporto Nluc/GFP dividendo il valore di luminescenza Nluc corretto per la fluorescenza GFP.