Western blot per la valutazione dell'integrità strutturale di un antigene batterico del vaccino

Prendi un gel SDS-PAGE contenente bande proteiche da particelle di proteina di membrana e nanolipoproteine. Questi complessi trasportano la proteina di membrana oligomerica della Chlamydia o MP, un promettente antigene vaccinale contro l'infezione da Chlamydia .

Utilizzare bande proteiche da MP oligomerico purificato come controllo.

Assemblare il gel, la membrana western blot e i componenti di blotting in un sistema di tamponamento a secco.

Applicare una corrente elettrica per trasferire le proteine risolte sulla membrana.

Rimuovere la membrana e incubarla in un tampone contenente detergenti e anticorpi primari.

I detergenti bloccano i siti di interazione aspecifici, mentre gli anticorpi primari hanno come bersaglio il MP.

Lavare la membrana per rimuovere gli anticorpi primari non legati.

Incubare con anticorpi secondari coniugati con fluorofori che hanno come bersaglio gli anticorpi primari.

Lavare la membrana per rimuovere gli anticorpi secondari in eccesso.

Cattura immagini a fluorescenza della membrana.

Le bande molecolari corrispondenti alla MP oligomerica di controllo confermano l'integrità strutturale della MP all'interno dei complessi, supportandone il potenziale antigenico.

Risolvere i campioni mediante SDS-PAGE e trasferire le pile di gel utilizzando un sistema di dry blotting commerciale per l'analisi Western blot. Rimuovere i blot dalla pila e incubarli per una notte a quattro gradi Celsius in un tampone bloccante contenente lo 0,2% di TWEEN 20 e 0,5 microgrammi per millilitro di MAb40, o 0,2 microgrammi per millilitro di anticorpo MAbHIS anti-HIS-tag diretto contro l'HIS-tag della proteina delta-49ApoA1.

Lavare ogni macchia con PBST tre volte per cinque minuti per lavaggio. Incubare i blot per un'ora in un tampone bloccante contenente un anticorpo secondario coniugato a un fluoroforo in una diluizione da 1 a 10.000. Ripetere i lavaggi con PBST e acquisire l'immagine utilizzando un imager a fluorescenza dopo il lavaggio finale.