JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:54 min • October 30th, 2025
Inizia con una coltura di cianobatteri, che sono batteri fotosintetici.
Questi batteri contengono goccioline di plastoglobuli ricche di lipidi e membrane tilacoidali, che sono strutture membranose ripiegate ricche di pigmenti fotosintetici.
Centrifugare la coltura e scartare il surnatante per rimuovere i polisaccaridi extracellulari prodotti dai batteri. Lavare il pellet, quindi rimetterlo in un tampone.
Utilizzare un omogeneizzatore ad alta pressione per generare una forza di taglio, che distrugge le pareti cellulari e le membrane.
La rottura delle membrane tilacoidi rilascia pigmenti fotosintetici nel lisato. Il rilascio del pigmento provoca un cambiamento di colore che indica la disgregazione cellulare e il rilascio di plastoglobuli.
Caricare il lisato nelle provette da centrifuga, quindi aggiungere una soluzione di saccarosio per formare un gradiente di densità.
Centrifuga per separare i componenti cellulari per densità.
Il tilacoide e altri componenti più pesanti si ritrovano nella parte inferiore, mentre i plastoglobuli a bassa densità galleggiano verso l'alto come una banda distinta.
Raccogliere la frazione di plastoglobulo e conservarla congelandola per ulteriori analisi.
Coltiva 50 millilitri di coltura di synechocystis species PCC 6802 in terreno BG11 per 7-10 giorni per raggiungere la fase stazionaria.
Utilizzando uno spettrofotometro, regolare la densità cellulare su una densità ottica di 2,0 a 750 nanometri. Per rimuovere i polisaccaridi, centrifugare 50 millilitri di coltura e rimuovere il surnatante. Ripetere il lavaggio delle cellule in 50 millilitri di tampone A due volte.
Risospendere il pellet lavato in 25 millilitri di tampone A e rompere le celle utilizzando una cella a pressione francese a 1.100 libbre di pollici quadrati. Ripetere il processo tre volte in condizioni di freddo fino a quando il colore lisato cambia da verde a rosso-blu-verde sotto la luce bianca. Rimuovere l'aliquota dell'omogeneizzato cellulare e metterla da parte per conservarla come campione totale rappresentativo di cellule.
Distribuire l'omogeneizzato risultante in otto provette per ultracentrifuga da tre millilitri riempite fino a un massimo di 2,5 millilitri in ciascuna provetta. Sovrapporre questo omogeneizzato con 400 microlitri di medio R, producendo un gradiente a gradini. Bilanciare attentamente le provette aggiungendo ulteriore mezzo R se necessario prima di centrifugare le provette.
Il tilacoide e altri organelli più pesanti, compresi i corpi di poliidrossialcanoato, mostrano la formazione di pellet, mentre i plastoglobuli formano un cuscinetto oleoso giallo sopra o vicino alla parte superiore del gradiente di saccarosio. Raccogliere il tampone galleggiante risultante di plastoglobuli grezzi con una siringa e depositare il raccolto in una provetta da due millilitri.
Se necessario, raschiare i plastoglobuli dal lato della parete della provetta dell'ultracentrifuga con la punta dell'ago. Continuare con la lavorazione dei cianobatteri o conservare i plastoglobuli grezzi a meno 80 gradi Celsius e purificarli in seguito.