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Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:03 min • October 30th, 2025
Inizia con una coltura di Legionella pneumophila, un batterio patogeno.
Queste cellule batteriche possiedono un sistema di secrezione sulla loro membrana, che è essenziale per l'infezione dell'ospite.
Sospendere le cellule batteriche in acqua sterile per ottenere la densità richiesta per l'imaging con tomografia elettronica criogenica (cryo-ET).
Aggiungi nanoparticelle d'oro, che fungono da punti di riferimento per l'allineamento dell'immagine durante la ricostruzione tridimensionale.
Prelevare una griglia con una pellicola di carbonio perforata per depositare il campione batterico.
Posizionare la griglia all'interno di una camera riempita di gas e applicare una scarica elettrica per rendere la superficie più idrofila.
Applicare la sospensione sulla griglia, lasciando che il liquido si distribuisca uniformemente sulla superficie e che le celle si depositino.
Rimuovere l'acqua in eccesso dalla griglia e immergerla in un mezzo di congelamento liquido per congelare il campione e preservarne l'architettura cellulare.
Il campione è ora pronto per l'imaging crio-ET del sistema di secrezione batterica.
Per preparare il campione di criotomografia elettronica, far crescere un pesante cerotto di Legionella Pneumophila su piastre CYE-agar-streptomicina per 48 ore a 37 gradi Celsius.
Risospendere le cellule in acqua a un OD600 di circa 0,7. Quindi aggiungere cinque microlitri di particelle di oro colloidale a 20 microlitri di sospensione cellulare. Scaricare una griglia di carbonio forata e pipettare su di essa cinque microlitri della miscela cellulare.
Lasciate riposare per un minuto. Tamponare la griglia con carta da filtro e congelarla in etano liquido utilizzando un apparato a stantuffo azionato a gravità.