Generazione di mutanti marcati con antibiotici nei cianobatteri tramite ricombinazione omologa

Inizia con una coltura di cianobatteri.

Centrifugare la coltura, quindi lavare delicatamente il pellet per preservare la superficie batterica del pili.

Centrifugare di nuovo, risospendere il pellet in un mezzo fresco e trasferirlo in una provetta.

Introdurre un vettore non replicante con un gene di resistenza agli antibiotici. Questo gene è affiancato da sequenze di DNA omologhe alle regioni situate a monte e a valle di un gene bersaglio nel genoma batterico.

Incubare per consentire l'internalizzazione pili-mediata del plasmide, che si allinea con le sequenze omologhe e sostituisce il gene bersaglio attraverso la ricombinazione, introducendo così una mutazione.

Distribuire le cellule sull'agar e incubarle, consentendo al gene della resistenza agli antibiotici di esprimere una proteina di resistenza.

Ricoprire la superficie dell'agar con agar contenente un antibiotico e incubare. La proteina di resistenza nelle cellule mutanti inattiva l'antibiotico, facilitando la loro sopravvivenza e la formazione di colonie.

Scegli le colonie sopravvissute e rimastica l'agar contenente un antibiotico per segregare i mutanti resistenti agli antibiotici.

Dopo aver preparato i terreni, i ceppi di cianobatte