Test fluorescente ad alta produttività per studiare le interazioni microbio-vermi

Inizia con un tubo contenente vermi C. elegans .

Trasferire i vermi su una piastra multipozzo con un mezzo di agarosio ricco di nutrienti contenente sia i batteri di controllo che quelli di test.

Durante l'incubazione, i vermi ingeriscono batteri, che colonizzano l'epitelio intestinale e rilasciano amminoacidi che fungono da fonte di nutrienti. Questi amminoacidi vengono metabolizzati in derivati amminoacidi e immagazzinati in granuli intestinali correlati ai losomi.

Successivamente, aggiungi un nuovo tampone e trasferisci i vermi su una piastra nera multipozzo per il saggio.

Aggiungi un induttore chimico di stress a ogni pozzo e sigilla la piastra di sicurezza.

Metti la piastra in un lettore di lastre a fluorescenza e registra la fluorescenza.

Nei vermi, l'induttore dello stress provoca stress ossidativo, che danneggia le cellule epiteliali intestinali.

Questo provoca la rottura dei granuli intestinali correlati ai losomi, rilasciando derivati amminoacidici che, esposti alla luce ultravioletta, fluoresce blu.

Confrontare la fluorescenza dei vermi esposti al batterio di controllo e testare per valutare l'efficienza della colonizzazione batterica e il loro impatto sulla risposta allo stress ossidativo dell'ospite.

Regola la concentrazione di vermi a 15 vermi per microlitro nel tubo conico da 15 millilitri. Successivamente, trasferire 8 microlitri di soluzione di vermi in ciascuno dei pozzi delle otto piastre di agarosio NGM da 96 pozzi utilizzando una pipetta multicanale o pipetta ripetuta.

Dopo 36 ore, eroga 30 microlitri di M9 in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzi. Successivamente, trasferire i verminetti sulla piastra a 384 pozzi secondo i layout del set utilizzando punte a bassa ritenuta, assicurandosi che i lettori di piastre siano posizionati correttamente. Successivamente, si completano le piastre da 384 pozzi con più M9, puntando a un volume finale di 60 microlitri per pozzo aggiungendo 40 microlitri di M9 per il test termico e 34 microlitri di M9 in 6 microlitri di TBHP per lo stress ossidativo indotto dal TBHP.

Poi, inizia il test entro due minuti dall'aggiunta di TBHP. Successivamente, chiudi le piastre con il loro coperchio trasparente e sigilla i bordi delle piastre a 384 pozzi con nastro da maschera, assicurandoti che il nastro non vada oltre il coperchio o sotto la piastra stessa. Poi, inserisci la piastra nel lettore di placche.