Preparazione di una piastra microfluidica con cellule batteriche

Si prenda una piastra microfluidica contenente coppie di pozzi di ingresso e uscita collegati da canali microfluidici, che includono canali serpentini e un canale sperimentale.

Per preparare i canali, aggiungi il supporto all'output well.

Metti il piatto in una fase di piastra e sigillalo con un copritore sterilizzato.

Attiva il flusso di media dal pozzo di uscita a quello di ingresso per eliminare eventuali sacche d'aria intrappolate nei canali.

Togli il piatto. Elimina il materiale residuo dal pozzo di uscita e aggiungi una coltura batterica.

Al pozzo di ingresso, aggiungi un nuovo materiale per prevenire il riflusso d'aria. Rimetti il piatto sul palco.

Durante l'osservazione al microscopio, riprendere il flusso per attirare le cellule nel canale sperimentale.

Regolare la portata per evitare l'ingresso delle celle nei canali serpentini e evitare l'intasamento.

Fermare il flusso e incubare per facilitare l'attacco batterico.

Rimuovi la piastra e scarta la coltura batterica residua e il substrato.

I batteri all'interno della lastra microfluidica sono ora pronti per ulteriori esperimenti.

Per l'innesco, rimuovi prima la piastra microfluidica a 48 pozzi dall'imballaggio, senza toccare la superficie del vetro sul fondo della piastra e pulisci il vetrino sul fondo della piastra con un tessuto per lenti. Per preparare i canali microfluidici, pipettare 200 microlitri a 37 gradi Celsius con un mezzo minimo nel pozzo di uscita, facendo attenzione a evitare bolle. Poi posiziona il piatto sulla piastra di ripiazzo.

Pulisci l'interfaccia con etanolo, sigillandola sulla piastra una volta che l'etanolo si è asciugato. In modalità manuale sul modulo di controllo, imposta il fluido come brodo Luria-Bertani a 37 gradi Celsius, e il taglio massimo come cinque dyne per centimetro quadrato. Clicca sui pozzi di uscita per attivare il flusso dall'uscita al pozzo di ingresso, per preparare i canali.

Dopo cinque minuti, interrompi il flusso per prepararti alla semina e rimuovi con cura il piatto dal palco. Poi, aspirare qualsiasi mezzo residuo dal pozzo di uscita senza rimuovere alcun mezzo dal cerchio interno che conduce ai canali microfluidici. Per seminare i canali sperimentali, si aggiungono 300 microlitri di mezzo minimo nel pozzo di ingresso, seguiti dall'aggiunta di 300 microlitri di coltura batterica nel pozzo di uscita.

Riporta la piastra nella fase di imaging assicurandoti di pulire l'interfaccia con etanolo prima di posizionarla sulla piastra e usa il feed live della telecamera per mettere a fuoco un singolo canale. Durante il monitoraggio visivo del feed in tempo reale, riprendere il flusso a 1-2 dyne per centimetro quadrato per circa 2-4 secondi, per permettere alle cellule di entrare nel canale sperimentale ma non nei canali serpentini, e lasciare la piastra sul palco a temperatura controllata per un'ora, permettendo alle cellule di attaccarsi al vivo. Al termine del periodo di attacco, rimuovere con cura la piastra dallo stadio e aspirare i batteri dal pozzo di uscita senza disturbare il canale.

Poi, usa una nuova punta per pipetta per rimuovere il mezzo dai pozzi di ingresso.