Espressione indottibile della catena A della tossina ricina marcata con istidina in E. coli
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:57 min. • November 28th, 2025
Si inizia con colonie di E. coli contenenti un gene della polimerasi T7 regolata dall'operatore lac e un plasmide di espressione.
Il plasmide porta i geni della resistenza agli antibiotici e la catena della tossina A della ricina.
Il gene di resistenza è espresso costitutivamente, producendo una proteina di resistenza agli antibiotici.
Il gene RTA è marcato con istidina e regolato da un promotore T7 e da un operatore lac.
Inoculare le colonie in substrati integrati con antibiotici e incubare con scuotiture.
La proteina di resistenza agli antibiotici inattiva l'antibiotico, permettendo la crescita selettiva dei batteri portatori di plasmidi.
Trasferire la coltura su un substrato integrato con antibiotici e incubare con agitazioni per favorire la crescita batterica.
Abbassare la temperatura della coltura per migliorare il correttono piegamento della proteina RTA.
Aggiungi un induttore per alleviare la repressione delle lac. Questo innesca l'espressione della T7 polimerasi, dando inizio alla trascrizione RTA e alla sintesi proteica.
Centrifuga per raccogliere i batteri e scartare il soprandante.
Lava con un tampone, centrifuga e rimuovi il surnanteante.
Sospezione dei batteri che esprimono la RT
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