Una tecnica di cromatografia di affinità per la purificazione di una proteina batterica ricombinante

Prendi una sospensione di cellule batteriche che esprimono una proteina bersaglio marcata con poliistidina.

Sonicare sul ghiaccio per minimizzare la degradazione delle proteine. Le onde sonore ad alta frequenza lisano le cellule, rilasciando contenuti intracellulari, inclusa la proteina bersaglio.

Centrifuga per separare i detriti e trasferire le proteine contenenti il soprantantante in una siringa.

Filtrare il sovrantato per rimuovere gli aggregati e prevenire l'ostruzione della colonna della cromatografia.

Prendi una colonna di cromatografia di affinità a base di nichel e bilanciala per una purificazione ottimale delle proteine.

Carica il filtrato sulla colonna. Il tag poliistidina si lega agli ioni nichel sulla resina colonna, immobilizzando le proteine bersaglio.

Lavare la colonna con un tampone per rimuovere le proteine non legate e monitorare l'assorbimento UV dell'eluato per confermare la rimozione delle proteine non bersaglio.

Aggiungi un tampone di eluzione contenente imidazolo, che compete con il tag poliistidina per il legame al nichel, rilasciando le proteine.

Un secondo picco nell'assorbenza UV conferma l'eluzione della proteina bersaglio, pronta per l'uso a valle.

Sonicare le