Una tecnica di cromatografia di affinità per la purificazione di una proteina batterica ricombinante

0 visualizzazioni2:54 min • November 28th, 2025

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Prendi una sospensione di cellule batteriche che esprimono una proteina bersaglio marcata con poliistidina.

Sonicare sul ghiaccio per minimizzare la degradazione delle proteine. Le onde sonore ad alta frequenza lisano le cellule, rilasciando contenuti intracellulari, inclusa la proteina bersaglio.

Centrifuga per separare i detriti e trasferire le proteine contenenti il soprantantante in una siringa.

Filtrare il sovrantato per rimuovere gli aggregati e prevenire l'ostruzione della colonna della cromatografia.

Prendi una colonna di cromatografia di affinità a base di nichel e bilanciala per una purificazione ottimale delle proteine.

Carica il filtrato sulla colonna. Il tag poliistidina si lega agli ioni nichel sulla resina colonna, immobilizzando le proteine bersaglio.

Lavare la colonna con un tampone per rimuovere le proteine non legate e monitorare l'assorbimento UV dell'eluato per confermare la rimozione delle proteine non bersaglio.

Aggiungi un tampone di eluzione contenente imidazolo, che compete con il tag poliistidina per il legame al nichel, rilasciando le proteine.

Un secondo picco nell'assorbenza UV conferma l'eluzione della proteina bersaglio, pronta per l'uso a valle.

Sonicare le cellule sul ghiaccio usando cinque cicli di impulsi di 15 secondi e una pausa di 30 secondi.

Dopo aver centrifugato il lisato cellulare a 21.000 g e quattro gradi Celsius per 15 minuti, filtrare il soprandanante usando un sistema di filtrazione sterile a siringa. Utilizzare un sistema di purificazione automatico, dotato di una colonna di affinità a base di nichel da cinque millilitri per purificare la frazione RTA contrassegnata con HIS dal supernatant E . coli filtrato sterile. In generale, si utilizza una velocità di eluzione di un millilitro al minuto e raffredda l'intero sistema di purificazione per prevenire il legame inefficiente delle tossine e la perdita di attività tossica.

Equilibrare brevemente la colonna di affinità con 20 millilitri di buffer di legame per rimuovere il buffer di stoccaggio. Poi, applica il surnatante sterile e filtrato sulla colonna di affinità usando una siringa. Lavare la colonna con 25-35 millilitri di tampone di legame per rimuovere le proteine non legate dalla colonna.

Esegui il passaggio di lavaggio finché l'assorbenza UV a 280 nanometri non è vicina al valore iniziale UV. Poi, eludi la frazione legata RTA con 20-35 millilitri di tampone di eluzione e tieni il campione sul ghiaccio. È importante iniziare il campionamento della frazione RTA poco dopo l'aumento del valore UV 280 e interrompere il campionamento della frazione RTA quando raggiunge nuovamente la linea di base originale.

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Ultimo aggiornamento: 1 agosto 2026