Una tecnica di cromatografia di affinità per la purificazione di una proteina batterica ricombinante
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:54 min • November 28th, 2025
Prendi una sospensione di cellule batteriche che esprimono una proteina bersaglio marcata con poliistidina.
Sonicare sul ghiaccio per minimizzare la degradazione delle proteine. Le onde sonore ad alta frequenza lisano le cellule, rilasciando contenuti intracellulari, inclusa la proteina bersaglio.
Centrifuga per separare i detriti e trasferire le proteine contenenti il soprantantante in una siringa.
Filtrare il sovrantato per rimuovere gli aggregati e prevenire l'ostruzione della colonna della cromatografia.
Prendi una colonna di cromatografia di affinità a base di nichel e bilanciala per una purificazione ottimale delle proteine.
Carica il filtrato sulla colonna. Il tag poliistidina si lega agli ioni nichel sulla resina colonna, immobilizzando le proteine bersaglio.
Lavare la colonna con un tampone per rimuovere le proteine non legate e monitorare l'assorbimento UV dell'eluato per confermare la rimozione delle proteine non bersaglio.
Aggiungi un tampone di eluzione contenente imidazolo, che compete con il tag poliistidina per il legame al nichel, rilasciando le proteine.
Un secondo picco nell'assorbenza UV conferma l'eluzione della proteina bersaglio, pronta per l'uso a valle.
Sonicare le cellule sul ghiaccio usando cinque cicli di impulsi di 15 secondi e una pausa di 30 secondi.
Dopo aver centrifugato il lisato cellulare a 21.000 g e quattro gradi Celsius per 15 minuti, filtrare il soprandanante usando un sistema di filtrazione sterile a siringa. Utilizzare un sistema di purificazione automatico, dotato di una colonna di affinità a base di nichel da cinque millilitri per purificare la frazione RTA contrassegnata con HIS dal supernatant E . coli filtrato sterile. In generale, si utilizza una velocità di eluzione di un millilitro al minuto e raffredda l'intero sistema di purificazione per prevenire il legame inefficiente delle tossine e la perdita di attività tossica.
Equilibrare brevemente la colonna di affinità con 20 millilitri di buffer di legame per rimuovere il buffer di stoccaggio. Poi, applica il surnatante sterile e filtrato sulla colonna di affinità usando una siringa. Lavare la colonna con 25-35 millilitri di tampone di legame per rimuovere le proteine non legate dalla colonna.
Esegui il passaggio di lavaggio finché l'assorbenza UV a 280 nanometri non è vicina al valore iniziale UV. Poi, eludi la frazione legata RTA con 20-35 millilitri di tampone di eluzione e tieni il campione sul ghiaccio. È importante iniziare il campionamento della frazione RTA poco dopo l'aumento del valore UV 280 e interrompere il campionamento della frazione RTA quando raggiunge nuovamente la linea di base originale.
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per la purificazione di proteine marcate con poliistidina da cellule batteriche. Il processo prevede sonificazione, centrifugazione e cromatografia di affinità su nichel per isolare in modo efficiente la proteina bersaglio.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Purificazione delle proteine
- Chimica biologica
- Biologia cellulare
Sfondo
- I tag poliistidinici sono comunemente utilizzati per la purificazione delle proteine.
- La cromatografia ad affinità consente l'isolamento selettivo delle proteine.
- La sonificazione è una tecnica utilizzata per lisare le cellule e rilasciare le proteine.
- Il monitoraggio dell'assorbanza UV aiuta a confermare il processo di purificazione.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo efficiente per la purificazione di proteine con tag HIS.
- Fornire un protocollo dettagliato per ricercatori in biochimica delle proteine.
- Evidenziare l'importanza del mantenimento dell'attività proteica durante la purificazione.
Metodi Utilizzati
- Sonicazione delle cellule batteriche per lisarle e rilasciare le proteine.
- Centrifugazione per separare i detriti cellulari dal soprannatante.
- Filtrazione del soprannatante per rimuovere gli aggregati.
- Cromatografia di affinità su nichel per la purificazione delle proteine.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di proteine marcate con poliistidina.
- Conferma dell'eluzione delle proteine mediante monitoraggio dell'assorbanza UV.
- Rimozione efficiente delle proteine non legate durante il passaggio di lavaggio.
- Mantenimento dell'attività proteica durante tutto il processo di purificazione.
Conclusioni
- Il metodo descritto è efficace per la purificazione di proteine con tag HIS.
- È fondamentale mantenere temperature basse durante la purificazione.
- L'assorbanza UV è un metodo affidabile per monitorare la purificazione delle proteine.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La cromatografia di affinità utilizzando resine a base di nichel consente una purificazione rapida e selettiva di proteine ricombinanti, supportando la validazione precoce del bersaglio e lo sviluppo di saggi nella ricerca biofarmaceutica&D. L'isolamento affidabile di proteine marcate con poliistidina garantisce una qualità costante dei reagenti per analisi successive e studi meccanicistici. Questo protocollo costituisce la base per la riproducibilità e la scalabilità nei flussi di ricerca preclinica e di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Biofarmaceutica R&D
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette la produzione di proteine ricombinanti ad alta purezza per la caratterizzazione funzionale e la validazione degli obiettivi.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica fornendo reagenti proteici costanti per l'analisi dei percorsi.
- Facilita una previsione affidabile nei saggi biologici in fase iniziale riducendo l'interferenza dei contaminanti.
Screening e sviluppo di saggi
- Fornisce preparati proteici standardizzati per la calibrazione dei saggi e i flussi di lavoro di screening di composti.
- Garantisce riproducibilità e coerenza quantitativa attraverso una purificazione monitorata con UV e un'eluzione controllata.
- Prepara input proteici validati per campagne di screening scalabili basate su piattaforma.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Fornisce continuità dalla scoperta agli studi preclinici, fornendo proteine funzionalmente integre per modelli in vitro e in vivo.
- Riduce il rischio di variabilità biologica negli studi traslazionali sui biomarcatori o sugli aspetti meccanicistici.
- Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio, garantendo il mantenimento della qualità e dell'attività delle proteine.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di purificazione per affinità si colloca all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e lo sviluppo del saggio, consentendo una transizione agevole verso la ricerca preclinica quando sono richiesti reagenti proteici ricombinanti.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e l'analisi dei percorsi metabolici fornendo proteine purificate e attive.
- Screening: Fornisce quantità proteiche riproducibili e quantitative per lo sviluppo di saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Utilizza il monitoraggio dell'assorbanza UV per la valutazione in tempo reale della purezza e del rendimento proteico.
- Ricerca traslazionale: Mantiene l'integrità delle proteine per studi successivi in modelli pertinenti alle malattie.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro standardizzato e scalabile per la purificazione di proteine ricombinanti in diversi programmi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nelle prime fasi della R&S.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la produttività della purificazione delle proteine.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento/cessazione e l'efficienza del capitale garantendo la coerenza dei reagenti.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione e l'avanzamento di asset scoperta e preclinici con una valutazione adeguata del rischio.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nell'espressione proteica, nella lisi e nella purificazione cromatografica.
- Necessita dell'accesso a sistemi automatizzati di purificazione e a infrastrutture per il monitoraggio dell'assorbanza UV.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le condizioni dei tamponi e i protocolli di eluizione.
- Adattabile a diversi bersagli proteici ricombinanti dotati di marcatori poliistidinici.
- Il controllo della temperatura è fondamentale per preservare l'attività proteica e prevenire perdite durante la purificazione.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Laboratorio scala di produzione e purificazione di un anticorpo terapeutico
Video correlati
0 Visualizzazioni
Quantificazione della lisciviazione dei metalli nella cromatografia di affinità metallica immobilizzata
Video correlati
0 Visualizzazioni
Purificazione per affinità di una proteina marcata 6X-His-Tagged utilizzando un sistema di cromatografia liquida proteica veloce
Video correlati
0 Visualizzazioni
Purificazione delle proteine ortogonali Facilitato da una piastrina Affinity Bispecific
Video correlati
0 Visualizzazioni
High-throughput Purificazione di affinità-tagged proteine ricombinanti
Video correlati
0 Visualizzazioni
Purificazione delle proteine basata sulla cromatografia a scambio anionico: una tecnica di separazione per isolare una proteina di interesse dal lisato batterico dializzato basato sulla carica netta
Video correlati
0 Visualizzazioni
Purificazione delle proteine basata sulla cromatografia di affinità al nichel: una tecnica per purificare le proteine ricombinanti marcate con poliistidina dal lisato cellulare batterico
Video correlati
0 Visualizzazioni
Una tecnica di cromatografia di affinità per la purificazione di anticorpi monoclonali
Video correlati
0 Visualizzazioni
Purificazione di nanoparticelle proteiche autoassemblanti mediante cromatografia di affinità
Video correlati
0 Visualizzazioni
GST-la sua purificazione: A Two-step Affinity Purification protocollo Cedendo Full-length proteine purificate
Video correlati
0 Visualizzazioni
Ultimo aggiornamento: 22 agosto 2026