Amplificazione isotermica mediata ad annello per il rilevamento di geni batterici

0 visualizzazioni2:48 min • November 28th, 2025

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Prendere un mix master contenente una DNA polimerasi che sloca il filo, nucleotidi e un colorante a doppio filamento per l'amplificazione isotermica mediata da loop o LAMP.

Aggiungi primer che contengano una sequenza complementare inversa specifica del gene batterico bersaglio.

Distribuisci il master mix nei tube.

Aggiungi campioni contenenti modelli di DNA batterico ai tubi.

Metti i tubi all'interno di uno strumento LAMP.

La denaturazione iniziale permette al primer di legarsi al DNA bersaglio.

Quando la DNA polimerasi che sposta il filamento inizia a sintetizzare un nuovo filamento, essa sposta il filamento esistente, eliminando la necessità di cicli termici.

Il prodotto amplificato forma una struttura ad anello dovuta all'accoppiamento inverso-complementare.

Questa struttura contiene più siti di partenza per il ciclo successivo, facilitando l'amplificazione esponenziale del DNA bersaglio.

Il colorante si lega al DNA amplificato ed emette fluorescenza.

Monitorare la fluorescenza in tempo reale per rilevare la presenza del gene batterico bersaglio nei campioni.

Separati fisicamente le aree utilizzate per preparare il LAMP Master Mix e aggiungere i template di DNA.

Pulisci le superfici di lavoro con isopropanolo e una soluzione degradante del DNA e della DNasi. Poi, pulisci le pipette e i porta-nisce per tubi. Scongelare il Master Mix isotermico, il Primer Mix 10X, acqua di grado molecolare, DNA di controllo positivo e template di DNA a temperatura ambiente.

Accendi lo strumento LAMP e inserisci le informazioni di campione rilevanti. Prepara il Master Mix LAMP secondo le indicazioni del manoscritto, vortice e centrifugalo brevemente, e distribuisci 23 microlitri del Master Mix in ogni pozzo di una striscia tubivanda. Vortice tutti i template di DNA e centrifugali brevemente.

Poi, aggiungi due microlitri di modello di DNA al pozzo appropriato e chiudi bene il pozzo. Rimuovi la striscia del tubo dal supporto e colpiscilo per assicurarti che tutti i reagenti si siano accumulati sul fondo del tubo. Carica la striscia a valvole nello strumento LAMP e avvia la corsa LAMP.

Mentre la reazione LAMP è in corso, tocca le schede Temperatura, Amplificazione e Anneal per vedere i cambiamenti dinamici di vari parametri durante l'esecuzione LAMP.

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Ultimo aggiornamento: 1 agosto 2026