JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
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Inizia con una coltura di Myxococcus xanthus, un batterio del suolo a crescita lenta.
Inoculare una colonia in un mezzo integrato con un antibiotico.
Le cellule sono state progettate per resistere all'antibiotico, assicurando che solo i batteri desiderati sopravvivano.
Trasferire la sospensione in una fiaschetta più grande contenente il mezzo e incubare con scuotimento per favorire una crescita ottimale.
Prendi un coperto montato su un telaio metallico, che fornisce supporto meccanico durante l'imagin.
Dispensa la coltura batterica sopra, poi aggiungi microsfere fluorescenti per servire come punti di riferimento per l'allineamento delle immagini mentre si acquisiscono più immagini.
Posiziona un tappetino di agarosio preriscaldato contenente il substrato, poi sovrapporlo con una copertura per mantenere l'idratazione.
Incubare per permettere alle cellule di aderire al cuscinetto di agarosio.
Il pad fornisce nutrienti alle cellule, consentendo l'imaging a lungo termine delle cellule vive dei processi cellulari durante la proliferazione nel batterio a crescita lenta.
Per cominciare, risospendere una singola colonia di M. xanthus in 500 microlitri di CTT all'1%, integrato con antibiotici, in un tubo sterile e trasferire l'intera sospensione in una fiaschetta Erlenmeyer da 50 millilitri contenente cinque millilitri di CTT all'1%. Prepara una soluzione microscopica di agarosio all'1% contenente 0,2% di CTT mescolando un grammo di agarosio con 80 millilitri di tampone TPM e 20 millilitri di mezzo CTT all'1%. Scalda la soluzione nel microonde finché l'agarosio non si è fuso.
Riempi una piastra di Petri con circa 60 millilitri di agarosio fuso e lascia raffreddare a temperatura ambiente. Preriscalda il tampone di agarosio a 32 gradi Celsius per almeno 15 minuti prima dell'uso. Poi, posiziona un giallo di vetro sterile su una struttura in plastica o metallo con un foro al centro. Poi usa del nastro adesivo per fissare il copricapo al telaio.
Aggiungi da 10 a 20 microlitri di cellule di M. xanthus cresciute esponenzialmente sulla copertura. Per aggiungere microsfere fluorescenti come marcatori fiduciali delle cellule, si utilizza il tampone TPM per diluire le microsfere a 1:100. Scuoti accuratamente la sospensione a talloni e aggiungi da cinque-dieci microlitri alle celle.
Dal grande cuscinetto di agarosio preriscaldato all'1%, ritaglia un piccolo tampone di dimensioni approssimativamente pari al biglietto di copertura e posizionalo sopra le celle. Poi posiziona un copricapo sopra il pad per prevenire l'evaporazione e mantenere le cellule in un ambiente umido. Incubare il campione di microscopia a 32 gradi Celsius per 15-20 minuti per permettere alle cellule di attaccarsi al fondo del tampone di agarosio prima delle registrazioni microscopiche a time-lapse.