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Preleva un campione di acqua di mare contenente diversi microrganismi, inclusi batteri ambientali che degradano gli inquinanti.
Diluire serialmente il campione per ridurre la densità microbica e riporlo su un mezzo nutriente.
Dopo l'incubazione, selezionano colonie morfologicamente distinte, che possono ancora ospitare tipi batterici geneticamente e metabolicamente diversi.
Stria ogni colonia selezionata per disperdere le singole cellule e incubarle.
Ogni cellula forma una colonia, rappresentando un isolato batterico geneticamente puro con un profilo metabolico distinto.
Inoculare ogni isolato in un mezzo di crescita e incubare per aumentare la biomassa.
Centrifuga la coltura, scartare il surnatante e lavare con un tampone per rimuovere il residuo del substrato.
Risospendere le cellule nel tampone e inocularle in un mezzo di selezione contenente EE2, un inquinante ambientale.
Essendo l'unica fonte di carbonio nel mezzo, EE2 seleziona batteri che possono metabolizzarlo per energia e crescita.
La torbidità nel mezzo indica la crescita batterica, confermando l'isolamento batterico che degrada gli inquinanti.
Per selezionare i batteri, si effettuano prima diluizioni seriali fino a 10 fino al negativo nove in soluzione salina sterile per i campioni di corallo e fino a 10 fino al negativo sei per i campioni d'acqua. La pipetta diluisce su e giù cinque volte prima di scartare la punta.
Poi, vortice ognuno. Vortice i campioni per cinque secondi ogni volta prima di eseguire la successiva diluizione seriale. Pipetta 100 microlitri di ogni diluizione su piastre di Petri contenenti 3% di cloruro di sodio per il brodo di lisogena, mezzo per agar e impiattale.
Incubare le placche per uno o tre giorni alla temperatura desiderata, ad esempio 26 gradi Celsius. Controlla le targhe una volta al giorno. Seleziona e isola le colonie che presentano morfologie di crescita distinte su nuove placche utilizzando la tecnica delle placche striate.
Ripeti questo passaggio tutte le volte necessarie per avere colonie pure che crescano sulle placche. Conservare gli isolati a quattro gradi Celsius o in glicerolo come descritto nel manoscritto. Per eseguire il test di capacità di degradazione EE2, si preleva una singola colonia dalle piastre fresche e inocula due millilitri di mezzo sterile LB in un tubo.
Se si tratta di una pellicola di glicerolo, prendi 10 microlitri di calcio batterico glicerolo e mettili su piastre di agar LB. Incubare a 24-28 gradi Celsius durante la notte per far crescere singole colonie. Posizionare il tubo contenente il medium LB inclinato sotto agitazione costante a 150 volte g a 24-28 gradi Celsius durante la notte.
Dopo la crescita batterica, si fanno una pellet centrifugandole a 8.000 volte g per otto minuti a temperatura ambiente. Scartate il soprannatante. Per lavare il brodo LB rimanente, aggiungi due millilitri di acqua salina per risospendere le cellule.
Ripeti il lavaggio due volte per assicurarti che non ci siano tracce di fonte di carbonio. Inoculare le cellule lavate e risospese in mezzo di coltura Bushnell Haas minimo contenente EE2 come unica fonte di carbonio. Valutare la crescita batterica tramite densità ottica a 600 nanometri e la nostra colonia formare unità su un mezzo agar LB dopo 16-72 ore di incubazione.