Name: Misurazione quantitativa della traslocazione GLUT4 sulla membrana plasmatica mediante citometria di flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Impara a quantificare la traslocazione di GLUT4 sulla membrana plasmatica mediante citometria di flusso in mioblasti mammiferi. Questo metodo permette di studiare la risposta all'insulina nel metabolismo del glucosio.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal Clifford signora Vecchio Bianco Graham Dotato Fondo di ricerca e il NIH (AR059838) a CB, dal NIH (AR052791, AR044387-ARRA, e NS063298) a LTT, e dal Baylor College of Medicine Citometria Ordinamento e Cell Core con finanziamenti del NIH (NCRR S10RR024574, NIAID AI036211, e NCI P30CA125123). I contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH.

1. La colorazione delle cellule <ol><li> Preparare le cellule. Le cellule devono essere utilizzati, pur in crescita attiva (60-80 confluenza%). Siero affamare le cellule durante la notte, la piastra loro celle a 0,1 milioni di euro oltre a 0,5 ml di siero-free medio nell'arco di 24 pozzetti e posto nell'incubatrice (37 ° C, 5% CO 2) per 30 minuti - 2 ore per il recupero da tripsinizzazione. </li><li> Mescolare gli anticorpi primari e secondari. Mix (5 ml di primaria anticorpi anti-GLUT4 con 1 ml di pollo secondario di capra anti-IgG coniugato con AlexaFluor 488) x numero di pozzi. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, al buio. </li><li> Preparare uno stock 2X lavoro di insulina da diluire in mezzo. </li><li> Verificare se le cellule hanno aderito o meno. </li><li> Mescolare delicatamente aggiungere 6 microlitri di anticorpi e 0,5 ml di vostro stock 2X lavoro di insulina per i pozzetti contenenti le cellule. Evitare qualsiasi turbolenza del mezzo. Incubare (37 ° C, 5% CO 2) per 30 minuti, al buio. </li><li> Fissare le cellule con l'aggiunta di 0,5 ml di PBS + 1% PFA ad ogni bene, senza tremare le cellule. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente, al buio. </li><li> Se le cellule hanno aderito ai pozzi, delicatamente ascensore con un sollevatore di cellulare. Trasferire le cellule (1 totale ml) in provette che stare in una citometro a flusso e centrifugare per agglomerare le cellule. </li><li> Lavare il pellet due volte con 1 ml di PBS e risospendere in 0,4 ml di PBS + 1% PFA. A questo punto, le cellule possono essere avvolti in pellicola e conservato in frigorifero (4-8 ° C) o adottate per il citofluorimetro per l'immediata acquisizione dei dati. </li></ol> 2. Acquisizione Dati <ol><li> Impostare un cancello largo intorno alle cellule vivono nel side scatter (SSC) in avanti rispetto a dispersione (FCS) del pannello. Utilizzare un tubo negativo (cellule non trattate con insulina o cellule "colorate" con un controllo isotipo) per impostare il parametro FL1. Assicurarsi che il picco è del tutto nel pannello, non tagliare sul lato inferiore. </li><li> Acquisire i dati di almeno 10.000 cellule per provetta. </li></ol> 3. Analisi dei dati <ol><li> Disegnare un gate intorno alle cellule vivono nel vs SSC FSC pannello (Figura 1A). Tracciare la istogrammi di AlexaFluor 488 intensità di fluorescenza in funzione del numero di cellule vive all'interno della cellula-gate (Figura 1B). È possibile sovrapporre diversi istogrammi di visualizzare le differenze, ma per la quantificazione, determinare l'intensità media e mediana di fluorescenza per ogni popolazione cellulare e utilizzare questi numeri per i confronti (Figura 1C). </li><li> Normalizzare i dati al valore ottenuto in assenza di insulina, come mostrato in Figure 1C e 1D. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati In mioblasti isolati da un individuo sano (non insulino-resistenza), l'insulina induce una dose-dipendente traslocazione di GLUT4 dal citoplasma alla membrana plasmatica (figura 1, a sinistra). Al contrario, l'insulina non induce traslocazione GLUT4 sulla membrana plasmatica di mioblasti isolati da un paziente con insulino-resistenza (figura 1, a destra). <img src="/files/ftp_upload/2429/2429fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esempio di un esperimento di colorazione. Mioblasti sono stati isolati da un donatore, senza insulino-resistenza (a sinistra) e da un paziente con insulino-resistenza (a destra). A, SSC (scatter laterale) rispetto FCS (forward scatter) trama con un cancello intorno alle cellule vive. B, cellule in gated A, colorate con l'anticorpo contro un epitopo esterno di GLUT4, e di sinistra non stimolate (rosso) o stimolati con insulina 1 nm (blu), 10 Nm (arancione), o 100 nm (verde). Per chiarezza la figura, si limita a mostrare i dati, senza e con 100 nM di insulina per le cellule con insulino-resistenza. C, media intensità di fluorescenza (MFI) degli istogrammi mostrato in B sono stati normalizzati per la MFI delle cellule non stimolate sinistra (non insulina). D, grafici dei dati normalizzati IFM dal istogrammi mostrato in B.

<ol><li>Zhao, F. Q., Keating, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+and+genomics+of+glucose+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Functional properties and genomics of glucose transporters.</a> Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).</li>
<li>Karnieli, E., Armoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+the+insulin-responsive+glucose+transporter+GLUT4+gene%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology.</a> Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).</li>
<li>Graham, T. E., Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+alterations+of+glucose+transport+and+molecular+mechanisms+of+intertissue+communication+in+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Metab.+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes.</a> Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+analysis+in+flow+cytometry%3A+the+future+just+started%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Data analysis in flow cytometry: the future just started.</a> Cytometry A. 77, 705-713 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo dimostrato una tecnica rapida per quantificare la traslocazione del GLUT4 dal citoplasma alla membrana plasmatica delle cellule mediante citometria di flusso. GLUT4 è solo transitoriamente espressa a livello della membrana plasmatica delle cellule ed è endocitosi. Dal momento che gli anticorpi legati rimanere attaccato al GLUT4, anche durante endocitosi, il segnale di fluorescenza fornisce la quantità totale di GLUT4 che è stato esposto a livello della membrana plasmatica per tutta la durata scelta di incubazione in presenza di insulina. Questa tecnica può essere applicata anche allo studio della traslocazione di altre proteine ​​da un compartimento intracellulare alla membrana plasmatica, ha fornito un buon anticorpo diretto contro un epitopo esterna della proteina di interesse è disponibile. Ad esempio, un test simile è oggi comunemente utilizzato per valutare il tasso di degranulazione di linfociti T citotossici e dei linfociti natural killer misurando la traslocazione di CD107a alla loro membrana plasmatica 4,5. La traslocazione della fosfatidilserina dal lato interno della membrana plasmatica verso il lato esterno durante l&#39;apoptosi delle cellule o necrosi può essere rilevata mediante citometria di flusso, utilizzando fluoroforo marcata con annessina V 6. Oltre rapidità del test, citometria a flusso presenta il vantaggio di permettere lo studio della traslocazione delle proteine ​​alla membrana plasmatica in popolazioni di cellule miste. Infatti, si può combinare colorazione per i marcatori sottoinsieme delle cellule e per la proteina di interesse, seguita dalla acquisizione dati su un multi-laser citofluorimetro 7. Le quantità di anticorpi di cui al paragrafo 1.2 del protocollo sono un punto di partenza, si consiglia di titolare il tuo anticorpi con le vostre cellule di interesse per determinare la concentrazione minima di anticorpi che ti dà un segnale di massima. Una buona gamma di partenza per il primario di anticorpi anti-umano GLUT4 che abbiamo usato qui sarebbe 1-10 microlitri per canna (cioè anticorpi 0,2-2 mg per provetta), ogni tubo contenente non più di 1 milione di cellule. Per gli altri anticorpi primari, fare riferimento alle istruzioni del fornitore. Normalizzazione dei dati è necessario in quanto autofluorescenza di cellule varia dal donatore al donatore e da esperimento per esperimento.

<table><tbody><tr><td>Anticorpi anti-umano GLUT4</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1606</td><td>Contro un epitopo esterno di GLUT4</td></tr><tr><td>Immunoglobulina G anti-caprina da pollo coniugata ad AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21467</td><td></td></tr><tr><td>Insulina umana ricombinante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Stecchette per colture cellulari</td><td>VWR international</td><td>29942-118</td><td>Tagliare per adattarle ai pozzetti</td></tr><tr><td>Tubi da 5 ml per FACS</td><td>VWR international</td><td>60819-138</td><td>Compatibili con tutte le macchine BD</td></tr></tbody></table>

misurazione quantitativa della traslocazione glut4 sulla membrana plasmatica mediante citometria di flusso

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Il glucosio è la principale fonte di energia per il corpo, che richiede una regolazione costante della sua concentrazione nel sangue. Il rilascio di insulina dal pancreas induce assorbimento del glucosio da parte dei tessuti insulino-sensibili, in particolare il cervello, muscolo scheletrico e adipociti. I pazienti affetti da diabete di tipo 2 e / o l&#39;obesità spesso sviluppano resistenza all&#39;insulina e sono in grado di controllare i loro omeostasi del glucosio. Nuove conoscenze sui meccanismi di resistenza all&#39;insulina può fornire nuove strategie di trattamento per diabete di tipo 2. La famiglia di trasportatori del glucosio GLUT è composto da tredici membri distribuiti su diversi tessuti in tutto il corpo 1. Trasportatore del glucosio di tipo 4 (GLUT4) è il principale trasportatore che l&#39;assorbimento di glucosio media da parte dei tessuti insulino-sensibili, come il muscolo scheletrico. Su legame dell&#39;insulina al suo recettore, vescicole contenenti GLUT4 traslocare dal citoplasma alla membrana plasmatica, inducendo l&#39;assorbimento del glucosio. Ridotta traslocazione GLUT4 è una delle cause della resistenza all&#39;insulina nei diabete di tipo 2 2,3. La traslocazione di GLUT4 dal citoplasma alla membrana plasmatica possono essere visualizzati mediante immunocitochimica, utilizzando fluoroforo-coniugati GLUT4 anticorpi specifici. Qui, descriviamo una tecnica per quantificare gli importi totali di GLUT4 traslocazione alla membrana plasmatica delle cellule durante un arco temporale scelto, citometria a flusso. Questo protocollo è rapido (meno di 4 ore, compresi l&#39;incubazione con l&#39;insulina) e consente l&#39;analisi di un minimo di 3.000 cellule o fino a 1 milione di cellule per ogni condizione in un singolo esperimento. Si basa su anti-GLUT4 anticorpi diretti contro un epitopo esterno del trasportatore che si legano ad esso non appena viene esposto al mezzo extracellulare dopo traslocazione alla membrana plasmatica.

Questo protocollo descrive una tecnica rapida per quantificare la traslocazione di GLUT4 dal citoplasma alla membrana plasmatica delle cellule mediante citometria di flusso.

Misurazione quantitativa della traslocazione GLUT4 sulla membrana plasmatica mediante citometria di flusso

Il glucosio è la principale fonte di energia per l'organismo e richiede una costante regolazione della sua concentrazione ematica. Il rilascio di insulina da parte del pancreas induce...

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare la traslocazione di GLUT4 sulla membrana plasmatica delle cellule di mammifero in risposta all'esposizione all'insulina. Mio blasti privati di siero, che possiedono solo la proteina GLUT4 intravesicolare, vengono inizialmente seminati in una piastra da coltura a 24 pozzetti con un anticorpo diretto contro un epitopo esterno di GLUT4. Successivamente viene aggiunto un anticorpo secondario coniugato a un fluorocromo, pre-incubato, seguito dall'insulina.L'attivazione dei recettori dell'insulina sulla superficie delle cellule provoca la traslocazione di Glute quattro alla superficie della membrana plasmatica. Glute quattro viene quindi riconosciuto dagli anticorpi presenti nel mezzo. A questo punto, le cellule possono essere fissate e l'intensità della colorazione fluorescente può essere misurata mediante citometria a flusso.Questo metodo può essere utilizzato per studiare la traslocazione di ggl quattro e il metabolismo del glucosio, ma può anche essere applicato ad altri sistemi, come la degranulazione delle cellule NK mediante esposizione di CD107a sulla membrana. Per questa procedura, è importante utilizzare cellule in crescita attiva o con una confluenza del 60-80% che siano state private di siero per tutta la notte. Dopo aver raccolto le cellule mediante tripsina, lavarle e risospendere in mezzo di crescita standard a 200.000 cellule per millilitro, piastrando le cellule in una piastra a 24 pozzetti con 0,1 milioni di cellule per 500 microlitri per pozzetto. Incubare quindi le cellule per un'ora a 37 gradi Celsius per consentire alle cellule di riprendersi dalla tripsina.Nel frattempo, mescolare l'anticorpo primario anti-glute quattro e l'anticorpo secondario coniugato con Alexa Fluor 488, antipollo IgG, in un rapporto di cinque a uno; calcolare il volume finale necessario, tenendo presente che verranno utilizzati 10 microlitri della miscela di anticorpi per ogni pozzetto. Incubare la miscela di anticorpi per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Durante l'incubazione della miscela di anticorpi, preparare una soluzione lavorativa di insulina due volte più concentrata, diluendola alla concentrazione desiderata nel mezzo di crescita.Dopo un'ora di incubazione, rimuovere le cellule dall'incubatore. Aggiungere delicatamente 10 microlitri di soluzione di anticorpo in ciascun pozzetto contenente cellule. Assicurarsi di lasciare almeno un pozzetto non colorato.Questo campione negativo verrà utilizzato successivamente per impostare il citofluorimetro. Successivamente, aggiungere 500 microlitri della soluzione madre di insulina al doppio in ogni pozzetto per indurre la traslocazione di Glut4 sulla superficie cellulare e incubare la piastra per 30 minuti a 37 gradi Celsius al buio. Dopo aver rimosso le cellule dall'incubatore, fissarle aggiungendo un millilitro di PBS con 1% PFA in ogni pozzetto e incubare la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente al buio. Utilizzando un cell lifter, staccare delicatamente le cellule fissate dal fondo dei pozzetti e trasferirle da ciascun pozzetto in un tubo FACS individuale.Centrifugare i tubi per formare il pellet cellulare, quindi vortexare e risospendere le cellule in un millilitro di PBS per lavarle e centrifugare nuovamente; ripetere il lavaggio. Eseguire due volte, scartando il soprannatante tra un lavaggio e l'altro.Infine, risospendere le cellule lavate in 400 microlitri di PBS con 1% di PFA. Le cellule possono ora essere analizzate per l'espressione superficiale di Glute quattro mediante citometria a flusso. Una volta arrivati al citometro a flusso con i campioni, iniziare l'acquisizione dei dati dal controllo non colorato.Definire una finestra ampia per cellule vive utilizzando i parametri di scattering anteriore e laterale. Regolare quindi l'impostazione della tensione per il canale FL1 in modo che il picco negativo sia visibile entro i margini dell'istogramma. Una volta impostati questi parametri, eseguire ogni campione sperimentale registrando almeno 10.000 eventi vitali per provetta.Questo istogramma mostra l'upregolazione della colorazione della forza glut di superficie nei mioblasti esposti a 0, 1, 10 o 100 nanomolari di insulina. Al contrario, i mioblasti di individui resistenti all'insulina non riescono a upregolare glu quattro in risposta a 100 nanomolari di insulina. Se le intensità fluorescenti medie delle cellule stimolate vengono normalizzate rispetto a quelle delle cellule non stimolate, è possibile confrontare direttamente le MFI dei mioblasti sani e di quelli resistenti all'insulina.Utilizzando questa procedura, le cellule possono essere colorate per ulteriori marcatori di superficie o intracellulari al fine di identificare diversi sottogruppi cellulari in popolazioni miste.

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