JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:35 min. • November 28th, 2025
Inizia con una piastra di coltura contenente batteri inseriti sotto un gel pad di agarosio per immobilizzare i batteri e sostenere la crescita del monostrato.
I batteri esprimono costitutivamente proteine fluorescenti verdi, consentendo un monitoraggio in tempo reale dell'espressione genica.
Versa ulteriore gel di agarosio intorno al tampone per sigillare il campione e lascialo solidificare a temperatura ambiente.
Sigilla la piastra con del nastro, perforala per permettere lo scambio di gas e invertisci per evitare la condensa.
Incubare la piastra a bassa temperatura per stabilizzare il gel e prevenire la divisione batterica.
Successivamente, applica olio a immersione sull'obiettivo e posiziona la piastra su un palco confocale del microscopio.
Avvia l'imaging time-lapse.
Man mano che la GFP matura gradualmente, inizia a fluorescere. Durante la divisione cellulare, queste proteine fluorescenti vengono distribuite tra le cellule figlie, causando un calo dell'intensità di fluorescenza.
Questo crea un pattern di fluorescenza a denti serrati, e le differenze in questo schema tra cellule geneticamente identiche nello stesso ambiente mostrano rumore biologico nell'espressione genica.
Per visualizzare i campioni, rimuovi la fiaschetta dall'acqua e lascia raffreddare la soluzione in gel alla temperatura corporea. Versa tre millimetri di gel sul perimetro della piastra campione. Quando l'agarosio si è solidificato, sigilla la piastra con nastro adesivo e usa un ago calibro 25 per perforare diversi fori nel nastro.
Poi posiziona la piastra capovolta a quattro gradi Celsius per almeno 30 minuti per permettere all'agarosio di solidificarsi completamente, prevenendo la mitosi cellulare. Entro 24 ore, utilizzare un microscopio confocale a fluorescenza per localizzare il campione al minimo ingrandimento e attivare il sistema di messa a fuoco automatico del microscopio. Applica l'olio sull'obiettivo appropriato e usa il controller della piattaforma per muovere la piastra e distribuire con cura l'olio.
Poi attiva nuovamente la messa a fuoco automatica e segui il suggerimento predefinito per le sezioni trasversali a passo Z per visualizzare il campione.