Un approccio basato sulla cromatografia liquida e la spettrometria di massa per l'analisi dei metaboliti di S. aureus

Si inizia con Staphylococcus aureus sospeso in una soluzione di tempra contenente perle di silice, conservate a bassa temperatura per preservarne lo stato metabolico.

Omogeneizzare i batteri in condizioni fredde per liberare contenuti intracellulari minimizzando la degradazione enzimatica dei metaboliti.

Centrifuga il lisato e raccoglie il soprandantato ricco di metaboliti.

Aggiungere un solvente organico all'estratto e al vortice per precipitare macromolecole da metaboliti solubili.

Centrifuga per mettere in pellet il precipitato e trasferire il soprantantante nelle fiale.

Carica le fiale in un sistema di cromatografia liquida-spettrometria di massa.

All'interno della colonna cromatografia, i metaboliti interagiscono con la fase solida e stazionaria in base alle loro proprietà chimiche.

Aggiungi un tampone per eluire i metaboliti. Successivamente, si dirigono i metaboliti nella sorgente di ionizzazione elettrospray dello spettrometro di massa per ionizzarli.

Gli ioni vengono poi separati in base al loro rapporto massa-carica.

I dati risultanti vengono confrontati con un database di riferimento per identificare i metaboliti.

Per iniziare l'estrazione dei metaboliti, prima scongelare i campioni su ghiaccio umido. Poi interrompi le celle in un omogeneizzatore con quattro raffiche di 30 secondi a 6000 giri/min, con periodi di raffreddamento di due minuti su ghiaccio secco tra un ciclo e l'altro.

Chiarisci i lisati per 15 minuti in un tubo microcentrifuga refrigerato pre-raffreddato alla massima velocità. Dopo la centrifugazione, trasferire il sovrantantante in un tubo pulito per microcentrifuga. Utilizzando una micropipetta, trasferire una piccola porzione del campione in un tubo microcentrifuga per quantificare il contenuto residuo di peptidi come descritto nel protocollo testuale.

Conserva il resto del campione a meno 80 gradi Celsius. Consulta il protocollo testuale per l'analisi dei metaboliti tramite cromatografia liquida e spettrometria di massa.