JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:22 min. • January 30th, 2026
Prendiamo globuli rossi di pecora (SRBC) opsonizzati con IgM, con anticorpi IgM legati agli antigeni della superficie cellulare.
Aggiungi siero contenente proteine del complemento tranne C5.
Il complesso C1 si lega agli anticorpi e diventa attivo.
La C1 attivata divide C4 e C2, formando la convertasi C3, che poi divide C3 e deposita C3b sugli SRBC.
Senza C5, C3b si degrada in C3bi.
Aggiungi le SRBC a una coltura di macrofagi.
C3bi si lega al recettore dei macrofagi, scatenando la fagocitosi SRBC.
Aggiungere una soluzione ipotonica per lisare e rimuovere gli SRBC non interiorizzati.
Aggiungi un buffer di lisi per lisare le cellule e rilascia emoglobina SRBC.
Introdurre un reagente di rilevamento.
In presenza di urea, l'emoglobina catalizza l'ossidazione del diaminofluorene da parte del perossido di idrogeno, generando un prodotto colorato.
Misurare l'assorbanza del prodotto colorato, che è proporzionale alle SRBC fagocitate.
Questo saggio modella la fagocitosi di batteri marcati da anticorpi utilizzando SRBC opsonizzati per imitare bersagli batterici.
Per un saggio di opsonizzazione, incubare 2 volte 10 alla 8ª globuli rossi di pecora o SRBC con 50 microlitri di immunoglobulina anti-SRBC M o IgM per 30 minuti a temperatura ambiente.
Successivamente incubare le SRBC opsonizzate con 50 microlitri di siero umano carente di C5 per 30 minuti a 37 gradi Celsius per fissare i frammenti del complemento C3b e inibitori di C3b sulle SRBC rivestite di IgM.
Successivamente, aspira il mezzo e aggiungi 100 microlitri di 1 per 10 ai sette SRBC opsonizzati per millilitro di mezzo in ciascun pozzo di una piastra da 96 pozzi contenente 1 volta 1 a 10 fino alla quarta macrafia murina coltivati durante la notte per pozzo.
Incubare la cocultura dei macrofagi di topo con SRBC per 1 ora a 37 gradi Celsius, poi rimuovere le SRBC non legate lavando con 100 microlitri di tampone di lisi cloruro di ammonio-potassio per 1 minuto.
Dopo che i SRBC non legati sono stati rimossi, risciacquare con 100 microlitri di substrato. Lisare le cellule rimanenti con dodecile solfato di sodio allo 0,1% e trattare i lisati con 50 microlitri di 2,7-diaminofluorene integrati con perossido di idrogeno al 3% e urea 6 molari.
Successivamente misura l'assorbanza della formazione blu di fluore catalizzata dall'emoglobina su uno spettrofotometro a 620 nanometri.
Utilizzare una curva standard a valori di assorbenza di 620 nanometri con numero noto di SRBC per determinare il numero di SRBC opsonizzati che sono fagocitizzati.