Ibridazione in situ fluorescente dei batteri intestinali nelle sezioni intestinali del topo

Inizia aggiungendo una soluzione contenente sonde batteriche di ibridazione in situ (FISH) specifiche per 16S rRNA su un vetrino contenente le sezioni intestinali del topo colonizzate dai batteri.

Inserire un copertura per distribuire le sonde contenenti liquido e prevenire l'evaporazione.

Incubare il vetrino in una camera umidificata a temperatura elevata.

Questo spiega la struttura secondaria dell'RNA, facilitando l'ibridazione della sonda con sequenze complementari nell'rRNA batterico 16S.

Rimuovere il copricapo e incubare il vetrione in un tampone di lavaggio preriscaldato per rimuovere le sonde non legate.

Risciacqua con un tampone fosfato per mantenere il pH fisiologico.

Applica una controcolorazione contenente un colorante specifico per muco e un colorante nucleare, e incuba.

Questi coloranti si legano selettivamente al muco intestinale e al DNA delle cellule batteriche e dell'ospite. Lava il carrello con un buffer e monta i coperchissi sul slide usando un supporto di montaggio.

Al microscopio confocale, osserva batteri distinti marcati come FISH, cellule intestinali e lo strato muco all'interno delle sezioni.

Crea cerchi molto stretti attorno a ogni sezione di tessuto usando un bloccante liquido o una penna PAP per limitare l'area di espansione che la soluzione di ibridazione deve coprire, evitando il contatto dell'inchiostro con la sezione.

Prepara la soluzione di ibridazione e aggiungi 0,5 microgrammi di sonda ogni 50 microlitri della soluzione utilizzata. Pipetta la soluzione sulle sezioni del vetrino. Sovrapporre la sezione con coperture flessibili in plastica, assicurando che il volume di liquido utilizzato copra l'intera sezione.

Crea una camera umida con una scatola a punta di pipetta con salviette o carta assorbente imbevuta con una soluzione ibridante eccessiva o PBS per fornire umidità. Incubare il vetrino nella camera umida a 45-50 gradi Celsius per almeno tre ore, a seconda della sonda impostata per ridurre l'evaporazione. Rimuovi le coperture di plastica e incuba le vetrine in un tampone di lavaggio FISH in un barattolo di Coplin, entrambe preriscaldate a 50 gradi Celsius.

Rimetti il barattolo Coplin nel forno a 50 gradi Celsius per 10-20 minuti. Rimuovi il buffer di lavaggio FISH e sostituiscilo con PBS nel barattolo Coplin. Immediatamente dopo aver riempito il barattolo di Coplin con PBS, decanta il PBS.

Rimuovi le vetrine dal barattolo e pipetta la controtinta sopra tutta la sezione, facendo attenzione a non toccare il fazzoletto con la punta della pipetta. Incubare a 4 gradi Celsius per 45 minuti. Lava le macchie tre volte velocemente con PBS fresco.

Strofina il retro delle vetri contro una salvietta o un tovagliolo di carta e lascia evaporare la maggior parte del PBS dalle sezioni, aiutato da una linea a vuoto collegata a una punta di pipetta. Monta le sezioni usando un mezzo di montaggio. Fissa le copertine al vegliello dipingendo lungo i bordi con uno smalto trasparente, facendo attenzione a stare lontano dal bordo del portino. Lascia che si fissi a temperatura ambiente.