Isolamento e coltivazione di Caenorhabditis elegans-Batteri associati

Inizia con una piastra multi-pozzetto contenente perline sterili e tampone in ogni pozzo.

Aggiungi un nematode di C. elegans in ciascun pozzo per isolare la comunità batterica.

Utilizzando un omogeneizzatore, si interrompono meccanicamente i nematodi per liberare i batteri nel tampon.

Centrifugare per separare i detriti cellulari e raccogliere il soprantantante contenente i batteri.

Impiatta la soluzione batterica diluita su piastre di agar nutritivi selettivi con composizioni variabili per supportare la crescita di diversi tipi batterici.

Incubare le placche per permettere ai batteri di moltiplicarsi e formare colonie visibili.

Utilizzando un anello sterile, scegli una singola colonia isolata e stirala su un piatto fresco dello stesso mezzo.

Incubare le placche per permettere la crescita di colonie batteriche pure.

Inocula ogni colonia pura nel corrispondente mezzo liquido e incuba.

Questi batteri crescono fino a diventare colture pure, ognuna rappresentando una specie batterica naturalmente associata a C. elegans.

Per isolare i batteri, prepara una piastra da 96 pozzi con circa tre perle sterili da 1 millimetro, 20 microlitri di tampone M9 per pozzo e pipetta un singolo nematode lavato in ciascun pozzo con il minor liquido possibile. Scomporre i nematodi come dimostrato prima di utilizzare un omogeneizzatore a perle, seguito da una breve centrifugazione della piastra per portare il liquido sul fondo. Una volta fatto, raccogli la sospensione e diluisci serialmente in proporzione da uno a dieci.

Placca fino a 100 microlitri della sospensione diluita su piastre di agar da 9 centimetri. Poi incubare le placche a 15-20 gradi Celsius per 24-48 ore. Per ottenere la coltura batterica pura, si preleva una singola colonia dalla piastra incubata usando un anello sterile o uno stuzzicadenti e si stria su una nuova piastra agar contenente lo stesso mezzo agar usato durante la purificazione. Assicurati di usare solo un terzo del piatto.

Poi, sterilizza un anello riutilizzabile o usa un nuovo anello sterile e trascinalo attraverso la prima striscia per creare una seconda striatura su un'altra parte di un terzo della piastra campionaria. Ripetilo trascinando un anello attraverso la seconda striatura e creando la terza striatura per ottenere la crescita della singola colonia.

Incubare la piastra nelle stesse condizioni di crescita utilizzate per l'isolamento e, se necessario, ripetere la fase di purificazione. Coltiva le colonie pure in un mezzo liquido utilizzando le stesse condizioni di temperatura e crescita.