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Microbiologia
0 visualizzazioni • 4:02 min • February 2nd, 2026
Prendiamo l'RNA totale estratto da un cervello di topo infettato da batteri patogeni. L'estratto contiene trascrizioni di geni sensibili all'infezione.
Aggiungi un enzima degradante del DNA e incuba per degradare il DNA genomico residuo.
Aggiungi un master mix contenente enzima trascridasi inversa (RT), nucleotidi e primer aspecifici.
Incubare per sintetizzare DNA complementare (cDNA).
Introduci una temperatura elevata per inattivare l'enzima RT.
Prendi un mix master contenente DNA polimerasi, nucleotide, un colorante a doppio filamento che lega il DNA e primer specifici per un gene bersaglio.
Aggiungi il cDNA e applica calore per denaturare il DNA.
L'innesco si lega al cDNA bersaglio, permettendo la sintesi di nuovi filamenti di DNA.
Il ciclo viene ripetuto per amplificare il gene bersaglio.
Il colorante si lega al DNA amplificato ed emette fluorescenza, che viene registrata alla fine di ogni ciclo.
L'aumento della fluorescenza conferma l'espressione del gene reattivo all'infezione nel cervello infetto del topo.
Infettare tutti i topi che utilizzano cellule planctoniche o cellule dello stato biofilm ed eseguire l'eutanasia come descritto nel protocollo testuale. Successivamente, estrai l'RNA totale dal tessuto cerebrale utilizzando un kit di estrazione di RNA.
Per ogni topo, si utilizza tessuto cerebrale intero per estrarre l'RNA. Dividere tutto il tessuto cerebrale in cinque tubi. Prendi fino a 100 milligrammi di tessuto cerebrale e aggiungi 1 millilitro di soluzione per la lisi a ogni tubo contenente la matrice di lisi fornita dal kit.
Estrai l'RNA seguendo i passaggi indicati nel protocollo testo. Successivamente, esegui la sintesi del cDNA, inclusa l'eliminazione del DNA genomico, utilizzando un termociclatore con un kit di reagenti per trascrizione inversa. Aggiungere 1 microgrammo di RNA a un tubo contenente 2 microlitri di 5x buffer di eliminazione del DNA genomico e 1 microlitro di enzima di eliminazione del DNA genomico.
Aggiungi acqua senza RNasi finché il volume non raggiunge i 10 microlitri. Incubare per 2 minuti a 42 gradi Celsius. Aggiungi 10 microlitri di master mixture alla soluzione di reazione e poi miscela delicatamente.
Procedere immediatamente con la reazione di trascrizione inversa posizionando il tubo a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Poi trasferisci la reazione a 85 gradi Celsius per 5 secondi. Esegui l'analisi quantitativa in tempo reale tramite PCR utilizzando una macchina PCR in tempo reale con un kit PCR in tempo reale quantitativo cibernetico. Seguendo le istruzioni del kit, combina l'enzima, i primer, il colorante di riferimento ROX 50x due e il template cDNA. Poi aggiungi acqua senza RNasi fino a raggiungere un volume totale di 20 microlitri.
Eseguire ogni campione in triplicata utilizzando i parametri termici elencati nel protocollo testuale e calcolare la variazione relativa di pieghe basandosi sul metodo CT di due meno delta delta.