Infezione orale di Drosophila melanogaster con batteri patogeni

Prendi una fiala con un coperchio che contiene agar nutritivo sovrapposto con carta filtrante.

Applica una sospensione di batteri patogeni sulla carta filtrante.

Inserisci una mosca di Drosophila melanogaster affamata nella fiala, poi posiziona il coperchio. Incuba per permettere l'alimentazione e garantire l'ingestione batterica.

I batteri ingeriti entrano nell'intestino e penetrano nella membrana protettiva che riveste il lume.

I batteri aderiscono all'epitelio sottostante, rilasciano tossine che favoriscono danni e invasioni epiteliali e colonizzano i tessuti interni.

Immergi la mosca nell'alcol per rimuovere i batteri associati alla superficie, poi risciacqua per rimuovere l'alcol.

Aggiungi un tampone e omogeneizza la mosca per liberare il contenuto batterico interno.

Eseguire diluizioni seriali dell'omogeneato in una micropiastra. Successivamente, piatta le diluizioni su agar nutritivo e incuba per permettere la formazione della colonia.

Contare le colonie per determinare il numero di cellule batteriche vitali derivanti da infezioni orali nella mosca.

Due o quattro ore prima dell'infezione orale, trasferire le mosche in fiale standard di agar senza cibo. Nel frattempo, per ogni mosca, prepara una fiala per l'infezione.

Per prima cosa, carica il coperchio di un tubo da 7 millilitri con 500 microlitri di agar standard e lascia che si solidifichi. Poi, infila un disco di carta filtro nell'agar. Poi pipetta 100 microlitri di coltura batterica direttamente sul disco filtrante. Per i controlli, usa acqua di saccarosio al 5%.

Dopo il periodo di fame, trasferire mosche singole ai tubi preparati. Dopo aver incubato le mosche per 18-24 ore, sterilizzarle in superficie. Carica gli individui in un tubo contenente 100 microlitri di etanolo al 70%.

Dopo 20-30 secondi, rimuovi l'etanolo e sostituisci con 100 microlitri di acqua tripla distillata. Dopo altri 20-30 secondi, rimuovi l'acqua. Poi aggiungi 100 microlitri di PBS e omogeneizza la mosca.

Trasferire l'omogeneato nella fila superiore di una piastra da 96 pozzi e aggiungere 90 microlitri di PBS 1x a ogni pozzo sottostante. Poi, utilizzando aliquote da 10 microlitri, diluisci serialmente questo campione per distinguere un intervallo di valori CFU. Successivamente, implattare le diluizioni seriali su una piastra di agar nutritivo LB in gocce da 5 microlitri.

Posiziona le goccioline in modo che siano posizionate discretamente sulla placca. Poi incubare il piatto durante la notte. Il giorno successivo, calcola il numero di CFU dalla diluizione che produce da 10 a 60 colonie chiaramente visibili.