Stabilire una popolazione batterica intestinale definita nelle zanzare adulte

Inizia con un bicchiere di carta contenente zanzare adulte, sigillato con garze per impedirne la fuga.

Posiziona dei batuffoli di cotone imbevuti in una soluzione contenente saccarosio antibiotico sulla garza e coprili con una piastra di Petri per mantenere l'umidità.

Mentre le zanzare si nutrono, ingeriscono gli antibiotici, eliminando il loro microbiota endogeno intestinale.

Rimuovi il cotone e inizia un periodo di carestia per eliminare gli antibiotici residui dall'intestino delle zanzare.

Prendi un tubo contenente batteri sospesi in una soluzione di saccarosio integrato con un fagostimolante per stimolare l'alimentazione.

Prendi un'unità di alimentazione sigillata, caricala con la sospensione batterica e fissala in sicurezza.

Collega l'unità a un dispositivo di alimentazione preriscaldato e posizionalo sopra la coppetta che contiene le zanzare pre-affamate.

Mentre le zanzare si nutrono, i batteri si spostano nell'intestino e lo colonizzano, formando una popolazione batterica definita.

Le zanzare nutrite che trasportano questa popolazione batterica sono pronte per studi di interazione ospite-patogeno.

Infiltra le palline di cotone sterili nella soluzione di saccarosio contenente antibiotici e posizionala sopra il bicchiere di carta contenente la zanzara.

Copri i batuffoli di cotone con una piastra di Petri da 10 centimetri per evitare che l'acqua evapori. Sostituisci le palline di cotone due volte al giorno e dai da mangiare alla zanzara per tre giorni consecutivi. Prepara la soluzione batterica. Misurare la soluzione batterica nello spettrofotometro visibile ai raggi UV. Aggiungi una sospensione di batteri OD nel tubo EP.

Centrifuga la sospensione a 5.000 RCF per 5 minuti a 4 gradi.

Scartate il soprannatante. Lava il pellet batterico tre volte con un buffer PBS sterile. Sospensione nuovamente il pellet batterico con un buffer sterile PBS da 200 microlitri. Aggiungi 600 microlitri di soluzione al 10% di saccarosio, 200 microlitri di ATP e 200 microlitri di sospensione batterica in un nuovo tubo EP e mescola bene. Aggiungi lentamente la soluzione batterica preparata all'unità alimentare, al massimo volume.

Per evitare le bolle cadevano da una direzione e sigillavano l'unità di alimentazione. Collega l'alimentatore. Aspetta che la temperatura raggiunga i 37 gradi. Installa l'unità di alimentazione con soluzione batterica sulla mangiatoia. Prima di nutrire i batteri, le zanzare devono essere fermate per 24 ore per metabolizzare gli antibiotici. Metti l'unità di alimentazione sul bicchiere di carta con le zanzare, poi lascia nutrire per 90 minuti. Le zanzare completamente ingrossate potevano essere selezionate per ulteriori studi.