JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
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Si inizia con embrioni transgenici di pesce zebra che esprimono macrofagi marcati fluorescenti, montati in agarosio a bassa fusione in un piatto di imaging.
Questi embrioni vengono infettati da Mycobacterium marinum marcato fluorescente tramite microiniezione intramuscolare nel mesencefalo, dando origine a una risposta immunitaria localizzata.
Coprire l'agarosio solidificato con substrati embrionali contenenti farmaci anestetici per mantenere l'anestesia e inibitori chimici per sopprimere la pigmentazione, garantendo chiarezza ottica per l'imaging.
Posiziona la piastra nella camera ambientale di un microscopio confocale ad alta risoluzione.
Utilizzando l'illuminazione a campo chiaro, individua la regione infetta.
Attiva i canali laser a fluorescenza, imposta le posizioni di inizio e fine dello stack Z e avvia l'imaging in time-lapse.
Visualizza il macrofago infetto, pieno di batteri fluorescenti, mentre diventa arrotondato e immobile.
Ciò indica il degrado del citoscheletro e l'insorgenza della morte delle cellule litiche.
Col tempo, il macrofago si gonfia e si rompe, rilasciando contenuti citoplasmatici e batteri interiorizzati nei tessuti circostanti, un segno distintivo della morte infiammatoria delle cellule litiche.
Una volta che l'agarosio si è completamente solidificato, coprire l'agarosio con uno strato di acqua di uovo. Dopo aver allestito la camera ambientale, posizionare il piatto con fondo di vetro da 35 millimetri con il pesce zebra nella camera ambientale. Apri il diodo 405, l'argon al 20% di potenza e il laser DPSS da 561 nanometri. Imposta la potenza laser appropriata nelle impostazioni dello spettro.
Scegli la modalità acquisizione "XYZ" "Scansione Sequenziale " e imposta il formato immagine su "512 x 512 pixel". Passa alla "Modalità Dati Live", mira alla posizione del primo pesce zebra e segna la posizione Z "Inizio" e "Fine ". Ripeti questo processo per ciascuno degli embrioni rimasti. Aggiungi una "Pausa" alla fine del programma. Definisci il ciclo e il ciclo del programma e salva il file.