Valutazione in vitro della uccisione batterica da parte dei fagociti splenici neonatali del topo

Inizia dissociando meccanicamente le milze neonatali per generare una sospensione a singola cellula.

Trasferisci la sospensione su un tubo, centrifuga e rimuovi il surnadante.

Risospendere il pellet nel tampone di lisi per eliminare gli eritrociti.

Aggiungi il tampone, centrifuga di nuovo e rimuovi il soprandante.

Risospendere le cellule in tampone e incubare con microsfere magnetiche rivestite di anticorpi che mirano a un recettore espresso su neutrofili e monociti infiammatori.

Centrifuga e rimuovi le perle non legate in centrifuga. Aggiungi il buffer, poi fai passare la sospensione attraverso una colonna ferromagnetica e applica un campo magnetico per trattenere le celle legate alla perla.

Rimuovere il campo magnetico, eluire le celle con il tampone e seminarle in una piastra multi-pozzo.

Aggiungi concentrazioni crescenti di batteri luminescenti in pozzi selezionati.

Incubare per permettere a neutrofili e monociti di interiorizzare i batteri tramite fagocitosi.

Sostituire il substrato con materiale contenente antibiotici per eliminare i batteri non interiorizzati.

Registrare la luminescenza a intervalli regolari per valutare l'internalizzazione batterica e la successiva uccisione indotta dalla fagocitosi.

Per eseguire un test batterico in vitro per uccidere, si posiziona la milza non infetta in un colino di nylon da 40 micrometri all'interno di una piastra di Petri sterile da 60 millimetri contenente 5 millilitri di PBS integrato con siero bovino fetale al 10%, e si utilizza uno sturalavandini sterile da 3 millilitri per disaggregare il tessuto in una sospensione monocellulare. Trasferire le celle in un tubo centrifugo da 15 millilitri e raccoglierle tramite centrifugazione. Risospendere il pellet in 1 millilitro di tampone di lisi dei globuli rossi ogni 3-4 milze.

Dopo 5 minuti a temperatura ambiente, lavare le milze con PBS e risospendere la pellet in 250 microlitri di PBS integrati con albumina sierica bovina e 2 millimolari EDTA per il conteggio. Successivamente, isolare le cellule positive a Ly6 B2 con le appropriate sfere immunomagnetiche secondo il protocollo del produttore e seminare le cellule Ly6 B2 positive arricchite a 1 per 10 fino a 5 cellule ogni 100 microlitri di mezzo completo per densità di pozzo in una piastra nera o bianca a 96 pozzi. Preparare l'inoculo batterico alla molteplicità desiderata di infezione in un volume finale di 100 microlitri per pozzo e aggiungere 100 microlitri di inoculo batterico o mezzo da solo a ciascun pozzo, per un'incubazione di 1 ora nell'incubatore di colture cellulari.

Al termine dell'incubazione, sostituire il mezzo con 200 microlitri di mezzo fresco completo integrato con 100 microgrammi per millilitro di gentamicina per rimuovere eventuali batteri extracellulari residui e restituire le cellule nell'incubatore di colture cellulari per ulteriori 2 ore. Al termine dell'incubazione e in ogni momento sperimentale successivo, si utilizza un lettore di placche per misurare la luminescenza in ogni pozzetto della piastra di coltura con coperchio prima di riportare la piastra nell'incubatore di colture cellulari fino alla prossima lettura.