Rilevamento in situ di batteri nelle sezioni di tessuto gingivole del topo

Prendere una sezione gengivale del topo infettata da batteri patogeni, pretrattata per accedere al DNA batterico.

Applica un tampone con una sonda a DNA marcata con digossigenina che prende di mira il DNA batterico.

Inserisci una copertura e sigilla per evitare la disidratazione del campione.

Introdurre calore per denaturare il DNA, poi incubare in condizioni calde e umide per permettere l'ibridazione della sonda.

Raffreddare il carrello e rimuovere il copertino, poi lavare più volte con un tampone per rimuovere le sonde non vincolate.

Aggiungi una soluzione bloccante per prevenire il legame non specifico degli anticorpi.

Incubare con anticorpi coniugati con enzimi che si legano alla digoxigenina.

Lava per rimuovere gli anticorpi non legati.

Aggiungere un inibitore per inattivare selettivamente l'enzima endogeno.

Applica un substrato che reagisca con l'enzima per ottenere un precipitato colorato.

Risciacquo con acqua per rimuovere il substrato in eccesso.

Aggiungi un colorante per colorare i nuclei.

Lava per rimuovere il colorante in eccesso.

Disidrata con etanolo e tratta con xilene per aumentare la trasparenza tissutale.

Montate la sezione.

Al microscopio, visualizza i batteri all'interno della sezione.

Inizia l'in-situ immergendo prima i vetri in 2x SSC per 20 minuti. Nel frattempo, diluire la sonda marcata a 1 nanogrammo per microlitro nel buffer di ibridazione. Per un controllo negativo, si utilizza una concentrazione 10 volte superiore rispetto a una sonda non marcata. Poi, denaturare le sonde riscaldandole a 90 gradi Celsius per 10 minuti, seguite da raffreddarle rapidamente sul ghiaccio.

Successivamente, applicare lo stesso volume di diluizione della sonda a ogni vetrina come la proteinasi K. Poi, copri con cura le sezioni di ingobbio e sigilla con lo smalto. Ora, riscalda i vetrini su un blocco PCR a 90 gradi Celsius per 10 minuti e trasferiscili in un incubatore umidificato a 45 gradi Celsius durante la notte.

Il giorno dopo, raffredda i vetri a 4 gradi Celsius per mezz'ora, poi rimuovi con cura le scavi di copertura. I tessuti sono fragili. Infine, fai passare i vetri attraverso una serie di buffer SSC a temperatura ambiente.

Lava le vetrine ibride in situ per 5 minuti in MABT. Poi, applica da 50 a 400 microlitri di soluzione bloccante a 1% Tween 20 per 20 minuti. Dopo l'incubazione a blocchi, applicare da 50 a 400 microlitri di 1-1000 anticorpi anti-DIG fosfatasi alcaline in soluzione bloccante.

Lascia legare per 90 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'applicazione del primario, lava i vetri in MABT per 10 minuti. Poi, per 5 minuti, metto le vetrine in un buffer di rilevamento con 1% Tween 20.

Ora applica da 50 a 400 microlitri di 1 millimolare levamisole in soluzione tampone di rilevamento su ogni vetri, e incubali per 5 minuti per inattivare la fosfatasi alcalina endogena. Successivamente, aggiungi da 50 a 400 microlitri di NBT/BCIP diluito in un tampone di rilevamento da 1 a 100 per ogni vetrina, e lascia incubare le vetrine per 2-3 ore in una camera umidificata, secondo l'esperienza.

Risciacqua i vetri con acqua DI. Poi, applica il verde metile allo 0,05% del peso in volume e lascia che la controcolorazione agisca sul tessuto per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Lava di nuovo i vetrini con acqua DI, poi disidratali con etanolo al 100%, seguito da un'immersione nello xilene. Infine, applica 80 microlitri di supporto e copri le vetrine.