Preparazione di colture di agrobatteri per la somministrazione di geni nelle cellule vegetali

Inizia con una coltura di Agrobacterium tumefaciens coltivata in un substrato integrata con due antibiotici per prevenire la contaminazione e garantire la ritenzione dei plasmidi.

I batteri contengono un vettore di espressione vegetale che porta un gene di interesse e un gene di resistenza agli antibiotici.

Contengono anche un plasmide aiutante con una regione di geni di virulenza necessaria per trasmettere il gene di interesse nelle cellule vegetali.

Trasferire una porzione in un tubo contenente un mezzo tamponato integrato con acetosiringone, una molecola di segnalazione di origine vegetale, e gli antibiotici. Incuba con lo scuotito.

L'acetosiringone si diffonde nella cellula, attiva una via di segnalazione e attiva l'espressione dei geni di virulenza necessari al trasferimento del gene di interesse.

Trasferire la coltura, centrifugare per raccogliere i batteri e scartare il surnatante.

Aggiungi un tampone salino e lava ripetutamente le cellule per rimuovere gli antibiotici aggiunti.

Sospendere i batteri nel tampone con acetosiringone e incubare senza scuotere per mantenere l'espressione genica della virulenza.

Usa subito la cultura per una trasformazione efficiente.

Usa una punta per prelevare una colonia positiva dalla piastra LB e inoculare le cellule in un tubo di vetro contenente 5 millilitri di LB media, integrati con 50 microgrammi per millilitro di Kanamicina e 50 microgrammi per millilitro di Rifampicina. Fai crescere le cellule a 30 gradi Celsius con scuotimento a 200 RPM per 24-48 ore.

Trasferire 100 microlitri della coltura in 5 millilitri di LB integrato con gli stessi antibiotici, 10 millimolari MES al pH 5,6 e 20 micromolari AS. Fai crescere i batteri a 30 gradi Celsius con tremori a 200 giri al minuto per 16-20 ore. Centrifuga le celle a 4.000 volte g per 10 minuti. Scartare il sovrantantante e risospendere il pellet in 2 millilitri di tampone di cloruro di magnesio da 10 millimolari.

Ripeti il lavaggio per assicurarti la completa rimozione degli antibiotici. Determinare la densità della coltura di Agrobacterium misurando la densità ottica a 600 nanometri. Regolare la coltura cellulare con un tampone di cloruro di magnesio a 10 millimolari a un OD₆₀₀ di 1,5-2,0.

Aggiungi 10 millimolari di MES al pH 5,6 e 150 micromolari AS alla coltura finale in sospensione e incuba le cellule a temperatura ambiente per almeno 3 ore senza scuotere.