Isolamento e coltivazione di batteri da embrioni di pesce zebra per valutare il carico infettivo

Prendiamo un embrione di pesce zebra infettato da Mycobacterium abscessus, un batterio patogeno che prende di mira il sistema nervoso centrale e forma ascessi contenenti batteri e cellule immunitarie dell'ospite.

Incubare l'embrione sul ghiaccio per immobilizzarlo, poi esporlo a un'overdose di anestetico per fermare l'attività cardiaca e neurale, causando la morte.

Lava l'embrione per rimuovere l'anestetico residuo.

Aggiungi una soluzione detergente per disturbare le membrane cellulari e lisare l'embrione.

Taglia il lisato attraverso un ago per omogeneizzare il tessuto e liberare i batteri.

Centrifuga, scartare il surnatant e risospendere il pellet in una soluzione di tensioativo per prevenire l'aggregazione batterica.

Diluire serialmente la sospensione batterica e diffonderla sulle piastre di agar.

Il mezzo viene integrato con antibiotici per inibire la crescita di altri microbi mentre le cellule di Mycobacterium progettate per la resistenza agli antibiotici proliferano.

Incubare per favorire la formazione della colonia, consentendo la quantificazione del carico batterico dell'embrione.

Per enumerare le unità formative di colonie o CFU nel momento desiderato, si prelevano cinque embrioni per ogni condizione di infezione e si trasferisce ciascun embrione in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Crianestesiare gli embrioni incubandoli sul ghiaccio per 10 minuti. Dopo l'eutanasia degli embrioni con 300-500 milligrammi per litro di tricaina, si utilizza acqua sterile per lavare gli embrioni due volte in un nuovo tubo.

Successivamente, dopo aver rimosso l'acqua al 2% Triton X-100 in 1 X PBS per ciascun embrione, si utilizza un ago calibro 26 per omogeneizzare il tessuto e ottenere una lisi completa.

Dopo aver centrifugato la sospensione, usa 1 PBST per risospendere il pellet. Successivamente, diluizione seriale delle omogeneazioni a placca su Middlebrook 7H10O ADC integrata con BBL MGIT PANTA.

Incubare le placche a 30 gradi Celsius per 4 giorni prima di contare le colonie.