Fetta Preparazione, coltura tissutale organotipica e Registrazione luciferasi di attività Clock gene nel nucleo soprachiasmatico

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come sezionare e isolare il nucleo soprachiasmatico da topi transgenici e coltivare il tessuto schematico al fine di registrare l'espressione di un gene orologio o di una proteina mediante luciferasi indotta da luminescenza. Questo viene realizzato innanzitutto isolando il cervello di un topo transgenico contenente un reporter di luciferasi per un gene orologio o una proteina, e successivamente preparando una sezione cerebrale contenente il nucleo soprachiasmatico. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'isolare i piccoli nuclei schematici bilaterali dalla sezione.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel coltivare il nucleo schematizzato explant su una membrana in una piastra di Petri contenente terreno di coltura e luciferina. L'ultimo passaggio della procedura è registrare l'attività della luciferasi misurando la bioluminescenza mediante tubi fotomoltiplicatori in una camera riscaldata e isolata dalla luce. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano l'oscillazione circadiana del gene orologio o della proteina.

Il mio nome è Sergey IV e lavoro nel Gabrielle Re Club. Il mio nome è SoFi Johansson e lavoro nel team di Gabriella. Il mio nome è Gabriel Quist.

Sono un ricercatore principale presso il Dipartimento di Neuroscienze, e il mio nome è Ka LaShon; sono uno studente di dottorato presso il Centro di Neuroscienze Mediche Svedesi e collaboro con Gabriella. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il Western Blot, la R-T-P-C-R e l'ibridazione in due fasi, consiste nella possibilità di seguire in modo continuo per molti giorni l'espressione di un gene o di una proteina del clock nello stesso tessuto, con una risoluzione molto elevata di circa un minuto, consentendo un'analisi dettagliata del periodo, dell'ampiezza e della fase del ritmo circadiano. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi di taglio e dissezione del SEN sono difficili da apprendere.

Il SEN è molto piccolo e può essere difficile da identificare. La procedura sarà dimostrata dalla dott.ssa Sge Velia, ricercatrice postdottorato nel mio gruppo di ricerca. Dopo aver preparato le soluzioni necessarie, preparare le piastre di Petri che verranno utilizzate nell'esperimento usando una siringa da cinque millilitri pre-riempita con grasso da vuoto autoclave.

Applicare il grasso sulla superficie superiore dell'anello di una piastra di Petri da 35 millimetri. Preparare una piastra di Petri separata per ogni fetta. Colture. Riempire una provetta Falcon con 10 millilitri di aria, mezzo di coltura tamponato.

Questo permetterà di ottenere quantitativo sufficiente di mezzo per otto colture. Aggiungere 10 microlitri di luciferina appena scongelata. La luciferina è sensibile alla luce, quindi proteggere il mezzo contenente luciferina dalla luce riponendo il tubo Falcon in una camera di riscaldamento buia a 37 gradi Celsius.

Successivamente, sterilizzare tutti gli strumenti, le coperture di vetro e gli altri materiali da utilizzare nella procedura. Spruzzare tutti gli strumenti non sterili con etanolo al 70%. Esporre gli strumenti e le piastre di Petri unte a raggi UV in una cappa sterile per almeno 30 minuti.

Un ulteriore passo preparatorio consiste nell'impostare il vibratomo e fissare una lama sterile di rasoio. A questo punto, l'attrezzatura è pronta per l'intervento chirurgico. Dopo aver anestetizzato e decapitato un topo, rimuovere gli occhi dalla testa con un paio di forbici.

Questo impedisce di stimolare o eccitare i nervi ottici, il che aiuta a evitare danni al nucleo soprachiasmatico o SCN. Utilizzare un paio di forbici fini per rimuovere l'ultima vertebra cervicale e rimuovere la pelle. Effettuare due incisioni nell'osso del cranio lungo entrambi i lati del cranio, creando così un coperchio asportabile.

Aprire il cranio con uno strumento micro Ron Jre. Utilizzare il RJ con un movimento ascendente, senza mai premere sul cervello con lo strumento. Per evitare danni al SCN coddle, rimuovere tutta l'osso fino a quando non si riescono a vedere i bulbi olfattivi.

Utilizzare un paio di forbici a molla fini per dissezione microscopica per tagliare con attenzione il nervo ottico tra gli emisferi e i bulbi olfattivi. Posizionare una piastra di Petri contenente da 50 a 100 millilitri di HBSS freddo sotto la testa del topo. Capovolgere la testa e lasciare che il cervello integro inizi a fuoriuscire.

Tagliare altri nervi cranici, se necessario, sul lato opposto rispetto al nervo ottico. Una volta staccato, il cervello cade nella piastra di Petri, che lo raffredda rapidamente. Utilizzare un cucchiaio per trasferire il cervello ghiacciato su una superficie sterile per il taglio, ad esempio il coperchio di una piastra di Petri in vetro capovolto.

Rimuovere il cervelletto effettuando un taglio perpendicolare con lame di rasoio sterili tra gli emisferi e il cervelletto. Applicare colla istantanea sulla piattaforma asciutta del viome. Inserire una pinza curva affilata nella parte rostrale del cervello e sollevare il cervello tenendolo con la pinza.

Asciugare attentamente l'HBSS su carta da filtro sterile. Fissare gli emisferi sulla colla della piattaforma con l'estremità rostrale rivolta verso l'alto e la superficie ventrale più vicina alla lama di taglio. Montare la piattaforma nel supporto del vibratome e riempirla immediatamente con HBSS freddo.

Se il taglio perpendicolare viene eseguito correttamente, gli emisferi dovrebbero rimanere in posizione verticale. L'obiettivo è ottenere sezioni coronali contenenti la regione media del SCN bilaterale, utilizzando la velocità massima del vibratomo. Iniziare a tagliare sezioni spesse da 500 a 800 micrometri dagli emisferi fino a raggiungere la commessura. Guarda.

Man mano che il chiasma ottico si allarga, accompagnato dalla riduzione dello spessore delle sezioni a 100 micrometri, continuare a sezionare nella direzione del coddle, rallentando progressivamente il movimento manuale orizzontale della lama finché non iniziano a comparire i due nuclei SCN. Utilizzare una lente di ingrandimento se necessario per visualizzare i nuclei quando si è raggiunto il livello del SCN. Tagliare una sezione del SCN di 250 micrometri.

Riempire un coperchio di una piastra di Petri di medie dimensioni con HBSS freddo utilizzando un pennello morbido. Sollevare e trasferire la sezione cerebrale del SCN nella piastra di Petri. Posizionare la piastra di Petri sotto un microscopio stereoscopico.

Il passo successivo consiste nel dissezionare l'SCN dalla sezione. Utilizzare il microscopio per verificare che l'SCN bilaterale sia chiaramente visibile almeno su un lato del taglio. Utilizzare una coppia di bisturi sterili per dissezionare un quadrato di tessuto, di circa 1,5 millimetri per lato, contenente entrambi gli SCN.

Tagliare il più vicino possibile al NSC. Senza rimuovere il tessuto del NSC, un piccolo pezzo del nervo ottico deve essere attaccato all'espianto, ma non devono essere inclusi altri nuclei. Tagliare a metà il tessuto contenente il NSC bilaterale per ottenere due NSC unilaterali.

Un SCN unilaterale può essere utilizzato come controllo in una cappa sterile. Con la luce spenta, aggiungere 1200 microlitri di mezzo Lucifer in una piastra di Petri di diametro 35 millimetri, quindi posizionare una membrana di coltura sulla superficie liquida. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria sotto la membrana.

Gli impianti sono di piccole dimensioni e difficili da prelevare. Pertanto, utilizzare una pipetta da 1000 microlitri con punta per aspirare l'espianto SEN nella punta e rilasciarlo sul filtro di coltura. Scartare l'eccesso di HBSS e, per la registrazione della luciferasi, posizionare un solo SEN per ogni piastra di Petri.

Sigillare la piastra di Petri con grasso utilizzando un vetrino di copertura di 40 millimetri di diametro. Aggiungere altro grasso se il sigillo non è stretto. Trasferire le piastre di Petri nell'apparato aluma cycle posizionato all'interno di una camera di riscaldamento, esente da luce, a 36-37 gradi Celsius.

Per iniziare la coltura, osservare le piastre di coltura e i gruppi di rilevatori a fotomoltiplicatore montati all'interno della camera del ciclo lum. Posizionare le piastre di coltura al di sotto dei fotomoltiplicatori a una distanza di circa uno o due centimetri. I fotomoltiplicatori rilevano e amplificano la luciferasi indotta dalla luminescenza.

Lo strumento software Luma Cycle viene utilizzato per l'acquisizione dei dati. I conteggi dei fotoni vengono integrati in intervalli da uno a 10 minuti per ottenere un'elevata risoluzione dell'espressione della proteina genica. L'espressione circadiana della proteina genica viene analizzata per determinare la fase, il periodo e l'ampiezza del ritmo.

Questa figura mostra registrazioni di bioluminescenza da colture di tessuto SCN sano e non sano. Questi topi sono stati mantenuti in un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di buio prima del prelievo del tessuto SCN. La linea nera mostra il ritmo circadiano delle registrazioni di bioluminescenza dell'espressione della luciferasi del periodo due.

In una fetta di SEN sana, la proteina oscilla con la variazione circadiana in cui l'espressione massima della proteina si verifica al tempo di zegaber, 12-13 o all'inizio dell'oscurità. Pertanto, la fase del ritmo genico dipende dal ciclo luce-buio a cui l'animale è stato sottoposto prima dell'eutanasia. La linea blu mostra le registrazioni di bioluminescenza da un SE e da una coltura che si è seccata dopo che la piastra è stata aperta al quarto giorno, indicato dalla freccia, e non è stata sigillata correttamente.

La linea rossa mostra le registrazioni di bioluminescenza da una coltura SCN non sana. Questa figura utilizza la coltura SCN in un esperimento farmacologico. La figura mostra un tracciato proveniente da una coltura trattata con un bloccante dei canali ionici HCN al momento indicato dalla prima freccia.

Nell'arco di due o tre giorni, il bloccante del canale ionico ha ridotto e poi arrestato l'oscillazione circadiana alla seconda freccia. Il farmaco è stato rimosso e sostituito con mezzo di controllo condizionato durante il tentativo di questa procedura. È importante ricordare di lavorare rapidamente ma con attenzione per mantenere il tessuto SEN vitale.

È inoltre importante standardizzare il sezionamento vibram in modo da ottenere ogni volta lo stesso livello del SEN. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come tagliare e dissezionare la coltura del SEN, l'organo SCN, tipicamente su una membrana, e monitorare l'espressione del gene orologio o della proteina come luciferasi indotta dalla luminescenza nelle colture.