Name: Fetta Preparazione, coltura tissutale organotipica e Registrazione luciferasi di attività Clock gene nel nucleo soprachiasmatico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-15T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Impara la preparazione di fette del nucleo soprachiasmatico di topo, la coltura organotipica e la registrazione dell'espressione dei geni dell'orologio biologico mediante luciferasi. Questo metodo consente il monitoraggio continuo dei ritmi circadiani in vitro.

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Questo lavoro è stato finanziato dal Medical Research Council svedese (K2009-75SX-21028-01-3, K2008-61x-20700-01-3); FONCICYT 000000000091984; le fondamenta della Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, Martha Lundqvist e Sigurd och Elsa Goljes Minne e Società Svedese di Medicina SLS-95151. Professor Gene D. Block, UCLA, si ringrazia per preziosi commenti sul manoscritto. Ringraziamo il dottor Michael Andäng e la dottoressa Helena Johard per il bloccante dei canali HCN, e il Prof. Abdel El-Manira per la fornitura di microscopio video. Considerazioni etiche: Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dal Karolinska Institutet e &quot;Stoccolma Norra Djurförsöksetiska Nämnd&quot;. Tutti gli esperimenti su animali vengono eseguiti con l&#39;intento di ridurre al minimo ogni possibile stress o disagio per l&#39;animale.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Vantaggi e svantaggi della tecnologia giornalista luciferasi In contrasto con ex metodi in vivo, come la RT-PCR, ibridazione in situ e Western blot che richiedono il campionamento dei tessuti in molti diversi momenti (per un periodo di bassa risoluzione di solito 2-4 ore a seconda della frequenza di campionamento) al fine di studiare diurno variazioni nelle espressioni dei geni e delle proteine, la tecnologia giornalista luciferasi permette ad alta risoluzione (1-10 min) studi di oscillazioni circadiane per molti giorni nella stessa preparazione. Gli studi in tal modo, il numero di animali utilizzati è ridotto al minimo e dettagliata degli effetti sulla fase e periodo del ritmo sono fattibili, che normalmente non è possibile utilizzando tecniche convenzionali di campionamento con risoluzione minimo storico. Tuttavia, anche se le misurazioni ampiezza relativa del ritmo sono possibili, va sottolineato che la tecnologia giornalista non è quantitativo e non può quindi essere utilizzato per misurare la quantità di geni trascritti o proteine ​​tradotte. Le registrazioni dei tessuti può essere avviato e analizzati immediatamente dopo la coltura, un grande vantaggio per studiare direttamente gli effetti molecolari dello stress in vivo, in vivo indotta dalla luce sfasamenti ecc cultura SCN organotipica permette di lungo periodo (settimane) la manipolazione farmacologica del cervello adulto tessuto contenente un intatto rete maturo sinaptica e la tecnologia giornalista luciferasi permette registrazioni stabile per molte settimane. Così, il tessuto non ha bisogno di essere neonatale o postnatale precoce al fine di ottenere colture sane e, in contrasto con l&#39;acuta fetta trattamenti farmacologici cronici possono essere eseguite. In contrasto con plasmide-reporter trasfezioni in colture cellulari, che non fanno portare alla incorporazione di DNA nel genoma, il transgenico-luciferasi modelli animali (così come Lenti-virus trasfezioni) sono favorevoli se alterazioni epigenetiche sono da studiare. Si deve in questo contesto inoltre ricordato che l&#39;imaging luminescenza è oggi possibile con telecamere CCD ad alta sensibilità 11, permettendo registrazioni anche nei neuroni SCN singola (~ 6-10 micron) e di altri tipi cellulari, utilizzati dai grandi laboratori studiando i ritmi circadiani. Infine, alcuni investigatori circadiano usa comunemente il monitoraggio di espressione molecolare con altri giornalisti, come la proteina fluorescente verde, al fine di studiare geni orologio / oscillazioni proteine ​​16-19. Aspetti di spessore della fetta Gli spessori qui raccomandato della fetta SCN (200-300 micron) potrebbe essere ridotto o aumentato, se desiderato. Tuttavia, anche se il tessuto si appiattisce sulla membrana dopo alcuni giorni di cultura, non è consigliabile superare i 500 micron di spessore della fetta inizialmente tagliati al fine di preservare la vitalità del tessuto 7. Una fetta più sottile di 100 micron è di ragioni meccaniche e pratiche difficili da maneggiare. Perché il tessuto SCN è eterogeneo lo spessore della fetta può influenzare la fase del segnale di uscita luciferasi, dal momento che diverse regioni del SCN (ad esempio il &quot;core&quot; rispetto al &quot;guscio&quot;, e delle regioni dorsali contro ventrale) oscillano con le diverse fasi 20 e differenziale re-sincronizzazione dopo sfasamenti 21. Lo spessore della fetta influisce anche sulla base del numero di fotoni da più tessuti emette un maggior numero di fotoni. L&#39;ampiezza delle oscillazioni molecolari possono in questo modo indirettamente essere influenzata dalle dimensioni del l&#39;espianto. Per queste ragioni, il controllo e colture trattate devono essere sempre delle stesse dimensioni, spessore e contenenti la stessa regione del SCN al fine di oscillare nella stessa fase e con la stessa ampiezza. I due nuclei unilaterale, invece, oscillano in fase tra loro e con ampiezze simili fino a quando il taglio vibratome è orizzontale e non inclinato (che a sua volta dipende dal taglio che la separazione tra il cervelletto e le due emisferi è perpendicolare per la superficie del tavolo). Un investigatore che esegue la coltura SCN possono verificare che le culture SCN non oscillano in fase tra loro. Praticare e standardizzazione della tecnica di taglio, cioè le fette sono sempre tagliati alla stessa rostro-caudale livello del SCN, migliorerà il risultato. Passaggi critici <ol><li> Apporto di ossigeno è fondamentale. Perché il cervello richiede un sacco di ossigeno 22, la procedura di taglio deve essere veloce (il più vicino è quello di 3,1-3,10 ~ 5-6 minuti il meglio è in modo da mantenere il tessuto sano). </li><li> Il SCN è sensibile alle variazioni di temperatura e lo scambio di media. Il SCN è sensibile alla temperatura e variazioni di temperatura possono grande sfasamento il pacemaker e causare artefatti sperimentali 23. Se media o soluzioni sono sostituiti o aggiunti durante un esperimento in corso, per esempio quando si applica un farmaco dopo un paio di giorni di cultura, i media o solution deve essere pre-riscaldato a 36-37 ° C (la stessa temperatura nella camera) prima di addizione. Negli esperimenti farmacologici che coinvolgono scambi di media, è importante lavorare sempre con la pre-condizione terreno di coltura cellulare. Inoltre / wash-out con fresco, mezzano incondizionato può potenzialmente sfasamento del ritmo molecolare SCN 24 nonché altre culture tipo di cellula 25. </li><li> Composizione media. E &#39;importante la cultura del tessuto di pH corretto e osmolalità. L&#39;aria-buffering terreno contiene una grande quantità di HEPES, che ha una capacità ottimale del buffer nel range di pH 6,8-8,2 ed è anche adatto per il buffering dei cambiamenti di pH che possono verificarsi a causa della respirazione cellulare. HEPES, invece, è più sensibile alle variazioni di temperatura rispetto al bicarbonato di sodio, che è incluso in piccole quantità nel terreno di coltura. Bicarbonato di sodio ha una maggiore capacità di tamponamento del pH più basso (5,1-7,1) Gamma 26, in tal modo appropriato in un CO 2 nell&#39;atmosfera. Tuttavia, una maggiore quantità di bicarbonato di sodio in aria-buffering medium (DMEM 2902) aumenta la osmolalità modo significativo e non può essere aggiunto senza contemporaneamente diluire il mezzo, che a sua volta nella composizione errata di aminoacidi, vitamine e ioni. Consigli per la preparazione del mezzo: <ol><li> Essere preciso e attento durante la miscelazione del mezzo. </li><li> Utilizzare soluzioni di riserva solo fresco o appena scongelato. </li><li> In caso di osmolalità molto elevato non vale la pena di diluizione. Più di 5-6% di media-diluita molto probabilmente non funziona. Usare D-glucosio per aumentare osmolalità se è troppo bassa. </li></ol></li><li> Fase turni a causa di tempi di preparazione Il tempo di preparazione fetta è critica. Effetto nullo o minimo sui fase si ottiene se la procedura viene eseguita fetta tra ZT 6-12 dicembre. Tutte le dissezioni fetta devono essere effettuate presso la stessa fase del ciclo diurno o circadiano al fine di minimizzare l&#39;errore dovuto alla variazione di fase tra i preparativi. </li></ol> Eventuali modifiche <ol><li> Per elettrofisiologia SCN acuta, il taglio deve essere eseguito con una suoneria (Artificial liquido cerebrospinale; ACSF) tampone, satura di ossigeno (95% O 2, 5% CO 2) prima dell&#39;inizio taglio. Inoltre, l&#39;ossigeno è necessario aggiungere continuamente al buffer durante l&#39;intera procedura taglio, in quanto l&#39;attività elettrica e sinaptica è direttamente dipendente dalla fornitura di ossigeno 22. </li><li> Fette orizzontale e sagittale può anche essere successo preparato e colto del SCN. Gli autori hanno esperienza con le registrazioni luciferasi a fette orizzontali, che secondo la nostra esperienza dare oscillazioni circadiano con minore ampiezza rispetto al taglio coronale. </li><li> Il SCN è di circa 1 mm di lunghezza rostro-caudale e la tecnica di taglio qui descritto è indirizzati verso l&#39;acquisizione di una sezione di SCN nella regione centrale. Tuttavia, più di una sezione SCN possono essere ottenute da topo e cervello dei topi, permettendo l&#39;indagine del gene circadiano / espressione della proteina a livelli più rostrale rispetto caudale del nucleo SCN. </li><li> Culture fetta da animali giovani, cuccioli o anche dopo la nascita degli embrioni, può anche essere preparati. Si prega di notare che il cervello e il cranio in cuccioli molto giovani sono molto morbidi e sensibili. Inoltre, il nervo ottico è sottile e non pienamente sviluppata. Fare attenzione quando sezionare il cervello dei cuccioli in modo che la regione SCN non sia danneggiato. Per esempio, i micro pinza ossivora strumenti non possono essere usati per aprire il cranio di cuccioli di topo, perché sono troppo grandi. Forbici sono sufficienti per tagliare i tessuti molli nei cuccioli giovani. </li><li> Il vetro di copertura tecnica basata cultura qui descritto può essere utilizzato anche per luminescenza immagine usando un CCD / EM-CCD, anche nei neuroni SCN singolo. </li><li> Altre regioni del sistema nervoso centrale e nei tessuti degli organi periferici da transgenici PER2:: LUC animali può essere facilmente ottenuto, colti e analizzati in termini di oscillazioni molecolari, come la PER2:: LUC espressione continua ad oscillare per molti giorni anche in diversi altri tessuti e tipi di cellule 10. La maggior parte di questi tessuti periferici, per il fegato esempio, non richiedono una membrana per la sopravvivenza, ma sono invece colti direttamente immerso nel mezzo 11. Si prega di notare che la fase di spostamento a causa di sezionamento, coltura e lo scambio di media non può seguire gli stessi principi di SCN. </li></ol> Significato In topi transgenici e ceppi di ratto (mPER2:: LUC; mPer1-luc 8, 10, 27) l&#39;attività enzimatica luciferasi riflette proteina o ritmi espressione genica e può essere valutato mediante la registrazione bioluminescenza. La luciferasi generati bioluminescenza dà un segnale debole, ma la luminescenza di fondo è vicino a zero, rendendo questo metodo vantaggioso. Inoltre, poiché la molecola luciferasi è instabile e rapidamente degradata non c&#39;è phototossicità, che possono comparire durante il lungo periodo di illuminazione eccitatori 28. Prese insieme, queste caratteristiche permettono di lunga durata esperimenti di rendere la tecnologia giornalista luciferasi altamente vantaggiosa in ricerca circadiano.

<table><tbody><tr><td>Integratore B27 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetto</td><td>Menzel-Glaser</td><td>40#1</td><td>&amp;#8776; 40 mm</td></tr><tr><td>Membrane per coltura</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG50</td><td>0.4 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>DMEM a basso contenuto di glucosio senza rosso fenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2902</td><td>Polvere per 1L</td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1003 055</td><td>&amp;#8776; 55 mm</td></tr><tr><td>Set di filtrazione</td><td>Corning</td><td>431097</td><td>Dimensione pori 0,22 &amp;#x03BC;m polietersolfone</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Allgaier Instrumente</td><td>0203-7-PS</td><td>Dumant n. 7</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Invitrogen</td><td>14065-049</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>NaOCH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 7,5%</td><td>Invitrogen</td><td>25080-060</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Luciferina</td><td>Promega Corp.</td><td>E1602</td><td>Luciferina di coleottero, sale di potassio</td></tr><tr><td>Strumento micro rongeur</td><td>Allgaier Instrumente</td><td>332-097-140</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep 10.000 U/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>&amp;#8776; 35 mm</td></tr><tr><td>PMT</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>H9319-11MOD</td><td></td></tr><tr><td>Lame chirurgiche monouso</td><td>Paragon</td><td>P503</td><td>Taglia 11</td></tr><tr><td>Filtro a vuoto</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-5</td><td></td></tr><tr><td>Grasso per vuoto</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>50 g</td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fetta preparazione, coltura tissutale organotipica e registrazione luciferasi di attività clock gene nel nucleo soprachiasmatico

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Una centrale circadiano (~ 24 ore) orologio coordinamento ritmi quotidiani in fisiologia e del comportamento risiede nel nucleo soprachiasmatico (SCN) che si trova nell&#39;ipotalamo anteriore. L&#39;orologio è sincronizzato direttamente dalla luce attraverso la retina e del nervo ottico. Oscillazioni circadiani sono generati attraverso l&#39;interazione feedback negativo di una serie di cosiddetti &quot;geni dell&#39;orologio&quot; ei loro prodotti proteici, compreso il periodo (al) geni. Il clock del core dipende anche dalla depolarizzazione della membrana, di calcio e campo 1. Il SCN mostra oscillazioni giornaliere di espressione del gene orologio, l&#39;attività metabolica e attività elettrica spontanea. Sorprendentemente, questa attività ciclica endogena persiste a fette tessuto adulto del SCN 2-4. In questo modo, l&#39;orologio biologico possono essere facilmente studiate in vitro, permettendo indagini molecolari, elettrofisiologici e metabolici della funzione di pacemaker. Il SCN è una piccola struttura ben definita bilaterale trova proprio sopra il chiasma ottico 5. Nel ratto contiene ~ 8,000 neuroni in ogni nucleo e ha dimensioni di circa 947 micron (lunghezza, asse rostrocaudal) x 424 micron (larghezza) x 390 micron (altezza) 6. A sezionare il SCN è necessario tagliare una fetta cervello a livello del cervello dove il SCN può essere identificato. Qui, descriviamo la procedura di dissezione e taglio del SCN, che è simile per il mouse e il cervello di ratto. Inoltre, ci mostra come la cultura del tessuto sezionato organotypically su una membrana 7, una tecnica sviluppata per la cultura SCN tessuto da Yamazaki et al. 8. Infine, abbiamo dimostrato come il tessuto transgenici possono essere usati per misurare l&#39;espressione dei geni orologio / proteine ​​utilizzando la tecnologia dinamica luciferasi giornalista, un metodo che in origine era usato per le misurazioni circadiano da Geusz et al. 9. Noi qui utilizzare tessuti SCN dal transgenico knock-in PERIOD2:: topi luciferasi prodotto da Yoo et al 10.. I topi contengono una proteina di fusione del PERIODO (PER) 2 e l&#39;enzima luciferasi lucciola. Quando PER2 si traduce nella presenza del supporto per la luciferasi, cioè luciferina, l&#39;espressione PER2 può essere monitorato come bioluminescenza quando luciferasi catalizza l&#39;ossidazione della luciferina. Il numero di fotoni emessi è correlato positivamente alla quantità di proteina prodotta PER2, ei ritmi bioluminescenza corrispondere al ritmo PER2 proteina in vivo 10. In questo modo la variazione ciclica nell&#39;espressione PER2 può essere continuamente monitorato in tempo reale durante molti giorni. Il protocollo che seguiamo per la coltura dei tessuti e la registrazione in tempo reale bioluminescenza è stato accuratamente descritto da Yamazaki e Takahashi 11.

La procedura di fette preparazione contenente l&#39;adulto del mouse nucleo ipotalamico soprachiasmatico (SCN), e un modo rapido per la cultura del tessuto SCN in condizioni cultura organotipica, sono segnalati. Inoltre, la misurazione della oscillatorio espressione della proteina del gene orologio utilizzando la tecnologia dinamica luciferasi giornalista è descritto.

Fetta Preparazione, coltura tissutale organotipica e Registrazione luciferasi di attività Clock gene nel nucleo soprachiasmatico

Un orologio circadiano centrale (~24 ore) che coordina i ritmi quotidiani della fisiologia e del comportamento risiede nel nucleo soprachiasmatico (SCN) situato nel...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come sezionare e isolare il nucleo soprachiasmatico da topi transgenici e coltivare il tessuto schematico al fine di registrare l'espressione di un gene orologio o di una proteina mediante luciferasi indotta da luminescenza. Questo viene realizzato innanzitutto isolando il cervello di un topo transgenico contenente un reporter di luciferasi per un gene orologio o una proteina, e successivamente preparando una sezione cerebrale contenente il nucleo soprachiasmatico. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'isolare i piccoli nuclei schematici bilaterali dalla sezione.Il terzo passaggio della procedura consiste nel coltivare il nucleo schematizzato explant su una membrana in una piastra di Petri contenente terreno di coltura e luciferina. L'ultimo passaggio della procedura è registrare l'attività della luciferasi misurando la bioluminescenza mediante tubi fotomoltiplicatori in una camera riscaldata e isolata dalla luce. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano l'oscillazione circadiana del gene orologio o della proteina.Il mio nome è Sergey IV e lavoro nel Gabrielle Re Club. Il mio nome è SoFi Johansson e lavoro nel team di Gabriella. Il mio nome è Gabriel Quist.Sono un ricercatore principale presso il Dipartimento di Neuroscienze, e il mio nome è Ka LaShon; sono uno studente di dottorato presso il Centro di Neuroscienze Mediche Svedesi e collaboro con Gabriella. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il Western Blot, la R-T-P-C-R e l'ibridazione in due fasi, consiste nella possibilità di seguire in modo continuo per molti giorni l'espressione di un gene o di una proteina del clock nello stesso tessuto, con una risoluzione molto elevata di circa un minuto, consentendo un'analisi dettagliata del periodo, dell'ampiezza e della fase del ritmo circadiano. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi di taglio e dissezione del SEN sono difficili da apprendere.Il SEN è molto piccolo e può essere difficile da identificare. La procedura sarà dimostrata dalla dott.ssa Sge Velia, ricercatrice postdottorato nel mio gruppo di ricerca. Dopo aver preparato le soluzioni necessarie, preparare le piastre di Petri che verranno utilizzate nell'esperimento usando una siringa da cinque millilitri pre-riempita con grasso da vuoto autoclave.Applicare il grasso sulla superficie superiore dell'anello di una piastra di Petri da 35 millimetri. Preparare una piastra di Petri separata per ogni fetta. Colture. Riempire una provetta Falcon con 10 millilitri di aria, mezzo di coltura tamponato.Questo permetterà di ottenere quantitativo sufficiente di mezzo per otto colture. Aggiungere 10 microlitri di luciferina appena scongelata. La luciferina è sensibile alla luce, quindi proteggere il mezzo contenente luciferina dalla luce riponendo il tubo Falcon in una camera di riscaldamento buia a 37 gradi Celsius.Successivamente, sterilizzare tutti gli strumenti, le coperture di vetro e gli altri materiali da utilizzare nella procedura. Spruzzare tutti gli strumenti non sterili con etanolo al 70%. Esporre gli strumenti e le piastre di Petri unte a raggi UV in una cappa sterile per almeno 30 minuti.Un ulteriore passo preparatorio consiste nell'impostare il vibratomo e fissare una lama sterile di rasoio. A questo punto, l'attrezzatura è pronta per l'intervento chirurgico. Dopo aver anestetizzato e decapitato un topo, rimuovere gli occhi dalla testa con un paio di forbici.Questo impedisce di stimolare o eccitare i nervi ottici, il che aiuta a evitare danni al nucleo soprachiasmatico o SCN. Utilizzare un paio di forbici fini per rimuovere l'ultima vertebra cervicale e rimuovere la pelle. Effettuare due incisioni nell'osso del cranio lungo entrambi i lati del cranio, creando così un coperchio asportabile.Aprire il cranio con uno strumento micro Ron Jre. Utilizzare il RJ con un movimento ascendente, senza mai premere sul cervello con lo strumento. Per evitare danni al SCN coddle, rimuovere tutta l'osso fino a quando non si riescono a vedere i bulbi olfattivi.Utilizzare un paio di forbici a molla fini per dissezione microscopica per tagliare con attenzione il nervo ottico tra gli emisferi e i bulbi olfattivi. Posizionare una piastra di Petri contenente da 50 a 100 millilitri di HBSS freddo sotto la testa del topo. Capovolgere la testa e lasciare che il cervello integro inizi a fuoriuscire.Tagliare altri nervi cranici, se necessario, sul lato opposto rispetto al nervo ottico. Una volta staccato, il cervello cade nella piastra di Petri, che lo raffredda rapidamente. Utilizzare un cucchiaio per trasferire il cervello ghiacciato su una superficie sterile per il taglio, ad esempio il coperchio di una piastra di Petri in vetro capovolto.Rimuovere il cervelletto effettuando un taglio perpendicolare con lame di rasoio sterili tra gli emisferi e il cervelletto. Applicare colla istantanea sulla piattaforma asciutta del viome. Inserire una pinza curva affilata nella parte rostrale del cervello e sollevare il cervello tenendolo con la pinza.Asciugare attentamente l'HBSS su carta da filtro sterile. Fissare gli emisferi sulla colla della piattaforma con l'estremit&agrave; rostrale rivolta verso l'alto e la superficie ventrale pi&ugrave; vicina alla lama di taglio. Montare la piattaforma nel supporto del vibratome e riempirla immediatamente con HBSS freddo.Se il taglio perpendicolare viene eseguito correttamente, gli emisferi dovrebbero rimanere in posizione verticale. L'obiettivo è ottenere sezioni coronali contenenti la regione media del SCN bilaterale, utilizzando la velocità massima del vibratomo. Iniziare a tagliare sezioni spesse da 500 a 800 micrometri dagli emisferi fino a raggiungere la commessura. Guarda.Man mano che il chiasma ottico si allarga, accompagnato dalla riduzione dello spessore delle sezioni a 100 micrometri, continuare a sezionare nella direzione del coddle, rallentando progressivamente il movimento manuale orizzontale della lama finché non iniziano a comparire i due nuclei SCN. Utilizzare una lente di ingrandimento se necessario per visualizzare i nuclei quando si è raggiunto il livello del SCN. Tagliare una sezione del SCN di 250 micrometri.Riempire un coperchio di una piastra di Petri di medie dimensioni con HBSS freddo utilizzando un pennello morbido. Sollevare e trasferire la sezione cerebrale del SCN nella piastra di Petri. Posizionare la piastra di Petri sotto un microscopio stereoscopico.Il passo successivo consiste nel dissezionare l'SCN dalla sezione. Utilizzare il microscopio per verificare che l'SCN bilaterale sia chiaramente visibile almeno su un lato del taglio. Utilizzare una coppia di bisturi sterili per dissezionare un quadrato di tessuto, di circa 1,5 millimetri per lato, contenente entrambi gli SCN.Tagliare il più vicino possibile al NSC. Senza rimuovere il tessuto del NSC, un piccolo pezzo del nervo ottico deve essere attaccato all'espianto, ma non devono essere inclusi altri nuclei. Tagliare a metà il tessuto contenente il NSC bilaterale per ottenere due NSC unilaterali.Un SCN unilaterale può essere utilizzato come controllo in una cappa sterile. Con la luce spenta, aggiungere 1200 microlitri di mezzo Lucifer in una piastra di Petri di diametro 35 millimetri, quindi posizionare una membrana di coltura sulla superficie liquida. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria sotto la membrana.Gli impianti sono di piccole dimensioni e difficili da prelevare. Pertanto, utilizzare una pipetta da 1000 microlitri con punta per aspirare l'espianto SEN nella punta e rilasciarlo sul filtro di coltura. Scartare l'eccesso di HBSS e, per la registrazione della luciferasi, posizionare un solo SEN per ogni piastra di Petri.Sigillare la piastra di Petri con grasso utilizzando un vetrino di copertura di 40 millimetri di diametro. Aggiungere altro grasso se il sigillo non è stretto. Trasferire le piastre di Petri nell'apparato aluma cycle posizionato all'interno di una camera di riscaldamento, esente da luce, a 36-37 gradi Celsius.Per iniziare la coltura, osservare le piastre di coltura e i gruppi di rilevatori a fotomoltiplicatore montati all'interno della camera del ciclo lum. Posizionare le piastre di coltura al di sotto dei fotomoltiplicatori a una distanza di circa uno o due centimetri. I fotomoltiplicatori rilevano e amplificano la luciferasi indotta dalla luminescenza.Lo strumento software Luma Cycle viene utilizzato per l'acquisizione dei dati. I conteggi dei fotoni vengono integrati in intervalli da uno a 10 minuti per ottenere un'elevata risoluzione dell'espressione della proteina genica. L'espressione circadiana della proteina genica viene analizzata per determinare la fase, il periodo e l'ampiezza del ritmo.Questa figura mostra registrazioni di bioluminescenza da colture di tessuto SCN sano e non sano. Questi topi sono stati mantenuti in un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di buio prima del prelievo del tessuto SCN. La linea nera mostra il ritmo circadiano delle registrazioni di bioluminescenza dell'espressione della luciferasi del periodo due.In una fetta di SEN sana, la proteina oscilla con la variazione circadiana in cui l'espressione massima della proteina si verifica al tempo di zegaber, 12-13 o all'inizio dell'oscurità. Pertanto, la fase del ritmo genico dipende dal ciclo luce-buio a cui l'animale è stato sottoposto prima dell'eutanasia. La linea blu mostra le registrazioni di bioluminescenza da un SE e da una coltura che si è seccata dopo che la piastra è stata aperta al quarto giorno, indicato dalla freccia, e non è stata sigillata correttamente.La linea rossa mostra le registrazioni di bioluminescenza da una coltura SCN non sana. Questa figura utilizza la coltura SCN in un esperimento farmacologico. La figura mostra un tracciato proveniente da una coltura trattata con un bloccante dei canali ionici HCN al momento indicato dalla prima freccia.Nell'arco di due o tre giorni, il bloccante del canale ionico ha ridotto e poi arrestato l'oscillazione circadiana alla seconda freccia. Il farmaco è stato rimosso e sostituito con mezzo di controllo condizionato durante il tentativo di questa procedura. È importante ricordare di lavorare rapidamente ma con attenzione per mantenere il tessuto SEN vitale.È inoltre importante standardizzare il sezionamento vibram in modo da ottenere ogni volta lo stesso livello del SEN. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come tagliare e dissezionare la coltura del SEN, l'organo SCN, tipicamente su una membrana, e monitorare l'espressione del gene orologio o della proteina come luciferasi indotta dalla luminescenza nelle colture.

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Questo è un protocollo di preparare e mantenere una preparazione neocorticale fetta di cultura organotipica allo scopo di effettuare registrazioni elettrica da neuroni piramidali.

Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia

Orologi circadiani funzionare all'interno di singole celle, cioè, sono cellule autonome. Qui, descriviamo i metodi per la generazione di cellule autonome modelli di orologio con tecniche non invasive, luciferasi a base di tecnologia in tempo reale bioluminescenza. Cellule Reporter fornire trattabili, sistemi modello per lo studio della biologia funzionale circadiano.

Monitoraggio Cell-autonome Ritmi orologio circadiano di espressione genica mediante bioluminescenza Reporter luciferasi

Fonte: Sabado, V., et al., Nagoshi, E. Imaging in tempo reale a fluorescenza con risoluzione a cellula singola di �Orologi circadiani nel cervello larvale Cultura. J. Vis. Exp. (2018).  Questo video mostra la procedura per incorporare il cervello  Drosophila in una matrice di fibrina, seguita da imaging a fluorescenza time-lapse di neuroni dell'orologio circadiano per analizzare l'attività ritmica sincronizzata con i cicli luce/buio.

Incorporamento del cervello di Drosophila in una matrice per l'imaging time-lapse dei neuroni dell'orologio circadiano

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Misura parallela di circadiano Clock espressione genica e la secrezione dell&#39;ormone in colture cellulari primarie umane

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