JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:46 min • February 26th, 2026
Si inizia con il soprannatante prodotto dal microbiota intestinale umano durante la fermentazione in vitro degli esosaccacaridi. Il soprantantante contiene acidi grassi a catena corta deprotonati (SCFA) e altri metaboliti.
Aggiungi acido metafosforico per abbassare il pH del soprandanante e vortice per mescolare a fondo. Questo converte gli SCFA nelle loro forme protone, adatte all'analisi della cromatografia a gas.
Centrifuga per separare i detriti e raccogliere il sovrantantante contenente SCFA e altri metaboliti.
Filtrare il soprandanante per eliminare i residui e evitare interferenze con la cromatografia.
In un sistema di cromatografia gasso-cromatografia ad alte prestazioni, si inietta il soprantantante nell'ingresso riscaldato per vaporizzarlo. Poi, si mescola il vapore con un gas inerte e si fa passare attraverso una colonna di fase statica polare per la separazione.
Gli SCFA interagiscono con la fase stazionaria della colonna e si separano in base alla loro volatilità, con gli acidi a catena più corta che eluiscono prima di quelli più lunghi.
Identificare le concentrazioni dei diversi SCFA confrontando i risultati con gli standard interni. Questo riflette la degradazione microbica degli esosaccaridi in condizioni simili all'intestino
Per studiare gli effetti dell'EPS sulla produzione di SCFA, aggiungere 1 millilitro di soprantativi fermentati a tubi centrifughe da 2 millilitri e aggiungere 0,2 millilitri di acido metafosforico al 25 peso/volume a ciascun campione. Vortice per mescolare accuratamente le soluzioni. Centrifuga le miscele a 13.000 volte g per 20 minuti.
Nel frattempo, preparare soluzioni di 120 millimolari di acidi acetici, propionici, butirici, isobutirici, valerici e isovalerici in tubette. Poi aggiungi 1 millilitro di ciascun acido preparato in un tubo contenente 1,2 millilitri di acido metafosforico al 25 peso/volume e caricali nella bottiglia campione dello strumento gascromatografia come cocktail standard.
Estrai i tubi dalla centrifuga e trasferisci i soprantanti in tubi nuovi. Utilizzare una siringa dotata di filtro da 0,22 micron per filtrare i soprantativi in nuovi tubi per l'analisi gas-cromatografia.