Imaging a time-lapse della segregazione cromosomica in batteri marcati con fluorescenza

Inizia con un tampone di agarosio ricco di nutrienti su una struttura metallica contenente batteri che esprimono origini cromosomiche marcate fluorescenti e microsfere fluorescenti.

Il tampone di agarosio supporta l'attacco e la mobilità batterica, e le microsfere fluorescenti servono da riferimento per tracciare la segregazione cromosomica.

Aggiungere olio a immersione alla lente obiettivo nella camera di incubazione preriscaldata di un microscopio a campo ampio invertito.

Posiziona il campione sopra la lente, poi focali su una regione che contiene più batteri e almeno una microsfera fluorescente.

Avviare l'imaging in time-lapse e catturare sia immagini a contrasto di fase che a fluorescenza.

L'origine di replicazione marcata fluorescentmente appare come un ammasso luminoso vicino a un'estremità della cellula.

Durante la divisione, l'origine si duplica; un cluster rimane all'estremità originale mentre l'altro si sposta verso l'estremità della cella appena formata.

Questa configurazione consente di tracciare la segregazione cromosomica su più divisioni e può essere adattata per visualizzare processi dinamici simili in altri batteri, incluse specie patogene durante le interazioni con l'ospite.

Per eseguire la microscopia time-lapse, accendi il microscopio e avvia il software di controllo del microscopio. Seleziona l'obiettivo corretto, gli specchi corretti e filtra per acquisire immagini a contrasto di fase così come immagini di proteine fluorescenti verdi, fluorescenti rosse o fluorescenti gialle. Aggiungi una goccia di olio a immersione di alta qualità sulla lente dell'obiettivo e sul fondo del campione pre-incubato a 32 gradi Celsius.

Con il lato del foro rivolto verso l'obiettivo, posizionare la struttura metallica con il campione sul palco del microscopio, poi fissare il campione saldamente nel supporto del palco. Concentrati sulle cellule spostando lo stadio nella direzione Z più vicino all'obiettivo. Quando l'olio sull'obiettivo e il campione entrano in contatto, sposta lo stadio nella direzione X/Y.

Passa al software Metamorph e apri lo strumento Acquisizione. Seleziona Contrasto di Fase nell'elenco a tendina Impostazioni e imposta il Tempo di Esposizione a 100 millisecondi. Clicca su Mostra in diretta, porta la cella nel piano focale e sposta il palco nella direzione X/Y finché più celle singole non sono visibili nel campo visivo.

Assicurarsi che almeno una microsfera fluorescente sia nella regione visibile per allineare successivamente le immagini acquisite. Successivamente, apri il wizard Multi-Dimensional Acquisition del software di controllo del microscopio per impostare un esperimento time-lapse che consenta al microscopio di acquisire immagini a più lunghezze d'onda e posizioni di stadio, se necessario.

Nella scheda principale, attiva time-lapse e Lunghezze d'Onda Multiple. Ulteriori schede appariranno sul lato sinistro della finestra. Clicca sulla scheda Salvataggio e seleziona Directory per selezionare una cartella vuota sul disco rigido del computer e salvare le immagini acquisite, poi attiva Incrementa Nome Base Se il File Esiste per assicurarti che i dataset consecutivi non sovrascrivano quelli precedenti. Assegna all'esperimento un nome con data e il nome o titolo della varietà dell'esperimento.

Clicca sulla scheda time-lapse per regolare i parametri del time-lapse, poi imposta l'Intervallo di Tempo a 20 minuti e imposta la Durata a 24 ore. Il numero di punti di tempo cambierà automaticamente. Ora, clicca sulla scheda Lunghezze d'Onda.

Seleziona il numero di lunghezze d'onda da acquisire per ogni immagine in ogni momento cambiando il numero. Seleziona Consenti la posizione AF separata memorizzata hardware per ogni lunghezza d'onda. Clicca sulla scheda Prima lunghezza d'onda dall'alto.

Nell'elenco a tendina Illuminazione, seleziona Contrasto di Fase. Seleziona 100 millisecondi per l'esposizione e, nel menu a tendina Acquisizione, seleziona Ogni punto temporale. Disattiva Auto Expose nella lista a tendina selezionando Mai e seleziona Ogni Acquisizione nella lista a tendina per Auto Focus.

Imposta l'esposizione per ogni lunghezza d'onda come appena dimostrato usando i seguenti parametri. Poi, per acquisire immagini da più posizioni di palco, nella scheda Principale, attiva Multiple Stage Positions. Clicca sulla scheda Stage e clicca sul pulsante Live per vedere il campo visivo.

Sposta il palco nella direzione X/Y finché un ROI non è nel campo visivo. Salva le coordinate X e Y nella scheda Stage cliccando sul segno più. Sposta nuovamente il palco nella direzione X/Y finché non si trova un nuovo ROI e salva di nuovo le coordinate cliccando sul segno più.

Continua finché non si salva il numero desiderato di regioni. Controlla ancora una volta che le celle siano a fuoco cliccando sulle diverse posizioni X e Y salvate, e avvia l'autofocus hardware premendo AFC hold per mantenere costante la posizione Z salvata durante l'esperimento. Avvia la registrazione in time-lapse nel wizard Multi-Dimensional Acquisition del software di controllo del microscopio cliccando su Acquisire.

Controlla che le celle siano ancora a fuoco dopo i primi momenti temporali delle registrazioni time-lapse per massimizzare la qualità delle immagini e rifocalizza se necessario.